机械加载改善高脂饮食诱导的肥胖相关骨丢失

2020-04-15 09:08王珂雨李心乐刘大全张平
天津医药 2020年3期
关键词:小梁骨量高脂

王珂雨,李心乐,2,刘大全,2,张平,2,3△

肥胖作为一种全身性代谢疾病,肥胖及其相关的代谢后遗症发病率在全球范围内逐年增加[1-2]。骨髓中的脂肪组织对骨骼发育产生负面影响,肥胖个体中骨折风险明显增加,这挑战了传统的脂肪量对骨骼健康起到保护作用的观点[3]。脂肪细胞主要由骨髓间充质干细胞产生,其与成骨细胞的关系比其他来源的间充质细胞更紧密[4]。且有证据表明,间充质干细胞向脂肪细胞分化的增强是导致骨质疏松的原因之一[5]。

由于肥胖的患病率逐年增加,且其并发症日趋增多,但传统的治疗方法并不能取得令人满意的疗效[6-7]。大多数患者服用双膦酸盐(一种用于治疗骨质疏松症的药物)来治疗肥胖引起的骨质流失[8],但长期使用会增加股骨骨折的发生率[9]。目前还没有针对肥胖相关的骨代谢疾病的有效治疗方法。机械加载是一种低频率、强度小、作用于膝关节等滑膜关节的温和机械刺激,能模拟人体主动运动,从而影响骨骼内部相关合成代谢反应的物理治疗手段。本课题组前期研究显示,对膝关节进行机械加载可以促进股骨颈和胫骨的创伤愈合[10-11],还能够促进血管重构和骨重建[12],但有关机械加载对肥胖导致的骨量丢失的影响尚不清楚。本研究通过建立肥胖性骨质流失的动物模型,探讨机械加载对肥胖引起的骨丢失的修复作用,并且初步探究其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 45 只 SPF 级 C57BL/6 雌性小鼠(14 周龄,体质量18~20 g)购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心,实验饲料选用含脂量为60%的高脂饲料,购自北京华阜康生物科技有限公司。小鼠饲养于室温(22±2)℃,湿度(55±5)%,明暗交替12 h 的环境中,整个实验过程中自由摄取食物和水。本实验获天津医科大学伦理委员会批准,符合实验动物伦理学的相关规定,动物饲养严格遵循天津医科大学实验动物管理规定。

1.1.2 主要试剂及仪器 苏木素-伊红(HE)染色剂购自北京索莱宝公司,MacNeal's染色剂购自美国Polysciences公司。碱性磷酸酶(ALP)购自中国Proteintech 公司,Runt 相关转录因子2(RUNX2)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)购自美国Cell Signaling Technology 公司,β-肌动蛋白(β-actin)购自美国Sigma 公司。体成分分析仪购自澳大利亚ImpediVet 公司,VMR型小动物麻醉机购自美国MATRX 公司,石蜡切片机购自德国Leica公司,光学显微镜购自日本OLYMPUS公司。本课题组自主研发的机械加载治疗仪器(中国发明专利号:201610779975.8)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将45只C57BL/6小鼠随机分成3组,为正常饮食对照(Sham 组)、高脂饮食(HF 组)和高脂饮食加载治疗(HF+L组),每组各15只。在研究初期,各组小鼠的体质量差异无统计学意义。Sham 组给予正常饮食,HF 组和HF+L组给予含脂量为60%的高脂饮食且持续8周。

1.2.2 机械加载 经4 周高脂诱导后1.5%异氟烷吸入麻醉HF+L组小鼠,将小鼠膝关节外侧、内侧放于加载螺旋杆和定子之间,调节螺旋,保证关节部位松紧适宜(可触及到小鼠踝关节动脉跳动)后进行机械加载(图1)。加载条件为1 N,10 Hz,单侧膝关节加载3 min/d,双侧共6 min/d,每周连续加载5 d,共加载 4 周[13]。在加载治疗的 4 周内,HF 组和 HF+L 组仍持续喂养高脂饮食,直至实验结束。Sham组和HF组小鼠给予假的机械负荷,将膝关节置于加载仪上,但不接受任何刺激。

1.2.3 收集动物体质量、摄食量等数据 小鼠摄食量采用每5天测量并统计1次的方法。小鼠体质量的测量分别选在造模前检测实验基线水平和治疗结束后。

1.2.4 体成分分析 在加载治疗结束,小鼠处死前进行身体成分分析。测量质量、体长(鼻尖到肛门的长度),将仪器的探针按颜色对应安装后,不同颜色探针按要求刺入特定的皮下位置。探针位置分布如下:红色探针位于鼻尖,黄色探针位于双耳连线中点,蓝色探针位于肛门上方,黑色探针位于尾巴距离蓝色探针1 cm(图2),测量并记录体脂含量、体质量指数(body mass index,BMI)等数据。

1.2.5 骨密度检测 采用数字化双能X 线骨密度仪对小鼠进行双侧股骨的骨密度检测,检测范围为双侧股骨全长(即从髂骨髋臼窝上缘至股骨末端下缘),检测指标为骨密度(bone mineral density,BMD)和骨矿物含量(bone mineral content,BMC)。BMD 和 BMC 的测量分别选在造模前和治疗结束后检测。计算上述指标的变化百分比:(治疗结束后-造模前基线水平)/基线水平×100%。

1.2.6 组织学分析

1.2.6.1 组织处理 小鼠断颈法处死后,将小鼠后腿的皮肤、肌肉及周围韧带剥离,保留完整股骨。10%中性福尔马林溶液将股骨标本固定3 d,再经过3 周的摇床慢摇脱钙(14%EDTA),再经过乙醇梯度脱水、二甲苯透明、过夜浸蜡后,最后使用石蜡包埋股骨标本,进行冠状位组织切片,厚度为5 μm。

1.2.6.2 HE染色 股骨组织切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后,HE 染色30 min,脱水、透明后,中性树胶封片,光学显微镜下观察股骨的组织学变化[14]。每张切片在40倍镜下股骨远端生长板下方面积为2 mm2的长方形区域,进行数据采集分析。在蓝色区域(面积为2 mm2)内分别选取3 个100 倍视野,选取每组6 例标本。测量骨小梁面积(B.ar)和镜下视野组织的总面积(T.ar),并计算骨小梁面积分数(B.ar/T.ar),以评估股骨的骨量流失[14]。测量股骨中脂肪细胞的数目(N.adipocytes),脂肪细胞面积(A.ar)和镜下视野组织的总面积(T.ar),并计算单位面积脂肪细胞数目(N.adipocytes/T.ar)和脂肪细胞面积分数(A.ar/T.ar),以评估高脂饮食诱导的脂肪侵袭股骨情况[15]。使用Olympus CCD DP73软件进行以上数据的测量。

1.2.6.3 MacNeal's染色 股骨组织切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后,硝酸银避光染色10 min,自来水冲洗3 min,Na2CO3-甲醛水溶液固定5 min,蒸馏水洗2 min,MacNeal's染色20 min,脱水、透明后树胶封片,光学显微镜下观察组织形态学改变,评估股骨中成骨细胞的数目。每张切片在股骨远端生长板下方区域(同HE染色测量区域一致)分别选取3个400倍视野,选取每组6例标本,每组共18个视野。测量成骨细胞数目(N.Ob)和骨小梁长度(BM),并计算MacNeal's染色阳性细胞数(成骨细胞数)占骨小梁长度的比值(N.Ob/BM),评估股骨的成骨细胞活跃情况。

1.2.7 Western blot 检测 ALP、RUNX2、C/EBPα 和 PPARγ 蛋白表达水平 每组分别取6 个股骨标本,在液氮冷冻状态下置于研钵中研磨后加入RIPA 裂解液反应20 min,4 ℃、10 000 r/min 离心10 min,取上清液,测量蛋白浓度。每孔取 20 μg 蛋白行SDS-PAGE(恒压120 V,2 h)。在4 ℃情况下,恒流350 mA 转膜2 h。后使用5%脱脂牛奶封闭2 h,用 1×TBST 洗膜后,一抗 4 ℃过夜孵育(ALP:1∶2 000;RUNX2:1∶1 000;C/EBPα:1∶1 000;PPARγ:1∶1 000;βactin:1∶10 000),1×TBST 清洗5 次,二抗(1∶20 000)室温孵育90 min,用凝胶成像系统经化学发光后检测相关蛋白的表达[13]。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计软件进行分析,实验相关数据以均数±标准差()的形式表示,采用单因素方差分析(ANOVA)进行多组间均数比较,采用LSD-t检验进行组间多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 机械加载对高脂饮食诱导小鼠的肥胖程度的影响 实验表明,机械加载并未干扰小鼠摄食能力,3组小鼠摄食量之间差异无统计学意义。在体型方面,各组小鼠呈现显著差异,其中HF 组体型较大,HF+L组与HF组相比较小,见图3。HF组体质量、体脂含量以及BMI 较Sham 组明显增加(均P<0.01),经机械加载治疗后发现,HF+L组小鼠上述指标低于HF组,但仍然高于Sham组(均P<0.01),见表1。

Tab.1 The comparison of body weight,body fat content and BMI before sacrifice between three groups表1 各组小鼠的处死前体质量,体脂含量和BMI的比较(n=10,)

Tab.1 The comparison of body weight,body fat content and BMI before sacrifice between three groups表1 各组小鼠的处死前体质量,体脂含量和BMI的比较(n=10,)

**P<0.01;a与sham组比较,b与HF组比较,P<0.05

组别Sham组HF组HF+L组F摄食量(g/d)3.03±0.58 3.19±0.67a 3.10±0.68ab 0.250体质量(g)20.23±1.23 30.47±3.43a 22.78±2.20ab 46.949**体脂含量(%)20.84±1.45 29.70±1.75a 22.91±1.56ab 84.446**BMI(kg/cm2)5.49±0.28 7.44±0.71a 6.02±0.47ab 37.776**

2.2 机械加载对肥胖小鼠骨量影响 骨密度检测结果表明,与Sham组小鼠相比,HF组小鼠的骨密度变化率和骨量变化率明显下降(均P<0.05)。机械加载治疗后,HF+L组小鼠的骨密度变化率和骨量变化率明显升高,但仍然较Sham组下降(均P<0.05),见表2。

2.3 机械加载对肥胖小鼠股骨形态的影响 股骨组织HE 染色显示,Sham 组小鼠骨髓腔生长板下方骨小梁分布均匀,HF组中生长板下方骨小梁数目和面积明显减少,而HF+L 组骨小梁数目较多,形态分布较规则,见图4。将骨小梁面积量化后结果表明,HF组骨小梁面积较Sham组明显减少,HF+L组骨小梁面积较HF组显著增加(P<0.05),见表3。

Tab.2 The comparison of bone mineral density change rates and bone mass change rates between three groups表2 各组小鼠的股骨密度变化率和骨量变化率的比较(n=10,)

Tab.2 The comparison of bone mineral density change rates and bone mass change rates between three groups表2 各组小鼠的股骨密度变化率和骨量变化率的比较(n=10,)

**P<0.01;a与sham组比较,b与HF组比较,P<0.05

组别Sham组HF组HF+L组F骨密度变化率(%)31.09±7.11 14.80±0.59a 21.72±0.65ab 23.428**骨量变化率(%)32.42±3.42 12.08±1.72a 20.38±1.14ab 118.277**

MacNeal's 组织学染色结果显示,Sham 组小鼠骨髓腔中成骨细胞为淡蓝色,呈立方型柱状均匀分布在骨小梁边缘;HF 组中成骨细胞数目明显减少,而HF+L 组成骨细胞数目较HF 组多,形态较规则,见图5。成骨细胞数目量化结果表明,HF 组的成骨细胞数目较Sham 组明显减少(P<0.001),HF+L 组的成骨细胞数目较HF组显著增加(P<0.001),但与Sham组相比差异无统计学意义,见表3。

2.4 机械加载对肥胖小鼠股骨中脂肪细胞的影响 HE 染色显示,Sham 组小鼠股骨远端生长板下方有少许白色类圆形的空泡样脂肪细胞,HF组股骨远端生长板下方出现大量白色类圆形的空泡样脂肪细胞(图4 所示),而HF+L 组中出现少量的脂肪细胞。对脂肪细胞进行量化处理后,与Sham 组相比,HF 组的脂肪细胞数目和脂肪细胞面积均显著增加(P<0.05)。经过膝关节加载治疗后,HF+L 组脂肪细胞数目和脂肪细胞面积均明显减少(P<0.05)。见表4。

Tab.3 The comparison of the percentage of trabecular bone area,the number of osteoblasts per unit length and the expression levels of ALP and RUNX2 in the femur between three groups表3 各组小鼠的股骨中骨小梁面积百分比、单位长度内成骨细胞数目、ALP和RUNX2的表达量的比较(n=6,)

Tab.3 The comparison of the percentage of trabecular bone area,the number of osteoblasts per unit length and the expression levels of ALP and RUNX2 in the femur between three groups表3 各组小鼠的股骨中骨小梁面积百分比、单位长度内成骨细胞数目、ALP和RUNX2的表达量的比较(n=6,)

*P<0.05,**P<0.01;a与sham组比较,b与HF组比较,P<0.05

组别Sham组HF组HF+L组F骨小梁面积(%)12.73±1.71 8.72±0.96a 10.32±0.78ab 16.516*成骨细胞数目(个/mm)29.15±3.02 17.39±2.93a 25.42±3.24b 23.040**ALP表达量1.00±0.00 0.82±0.05a 1.08±0.03ab 89.981**RUNX2表达量1.00±0.00 0.78±0.02a 1.08±0.05ab 142.071**

2.5 机械加载对股骨中成骨生成相关蛋白和脂肪生成相关蛋白表达的影响 股骨组织蛋白检测分析表明,与 Sham 组相比,HF 组中 ALP 和 RUNX2 的表达明显降低,C/EBPα 和PPARγ 的表达显著升高(均P<0.05)。而HF+L 组与 HF 组相比,ALP 和 RUNX2的表达显著升高,C/EBPα 和PPARγ 的表达明显降低(均P<0.05)。见表3、4,图6。

3 讨论

Tab.4 The comparison of the number of adipocytes per unit area,the percentage of adipocyte area and the expression levels of C/EBPα and PPARγ in femur between three groups表4 各组小鼠的股骨中单位面积内脂肪细胞数目、面积百分比,C/EBPα和PPARγ的表达量的比较(n=6,)

Tab.4 The comparison of the number of adipocytes per unit area,the percentage of adipocyte area and the expression levels of C/EBPα and PPARγ in femur between three groups表4 各组小鼠的股骨中单位面积内脂肪细胞数目、面积百分比,C/EBPα和PPARγ的表达量的比较(n=6,)

*P<0.05,**P<0.01;a与sham组比较,b与HF组比较,P<0.05

组别Sham组HF组HF+L组F脂肪细胞数目(个/mm2)20.33±4.18 31.33±4.72a 19.17±2.93b 3.648*脂肪细胞面积(%)6.43±3.52 17.07±7.35a 9.80±4.27b 7.626**C/EBPα表达量1.00±0.00 1.28±0.09a 0.97±0.01ab 47.989**PPARγ表达量1.00±0.00 1.12±0.02a 0.90±0.01ab 275.246**

3.1 机械加载治疗对体质量和体脂的影响 营养过剩(高热量饮食摄入)和荷尔蒙失调(绝经后雌激素缺乏)可能是肥胖症及其并发症的主要原因,而机体对于过剩的能量是以脂肪细胞的形式储存[16-18]。过度的脂肪堆积是导致代谢性疾病的主要原因。运动是减轻体质量、改善肥胖的有效方式,同时可以改善心肺功能和提高生活质量[19]。但运动减重一般很难长期坚持,见效比较缓慢,而且有可能会造成软组织损伤。因此,本研究探究了膝关节加载对肥胖的影响。首先小鼠经过8周的高脂饮食喂养建立了肥胖模型,HF 组的体质量、体脂含量和BMI 均显著高于Sham组。而膝关节加载治疗通过降低体质量、体脂含量和BMI,有效减缓了高脂饮食造成的肥胖的发生发展。这些结果显示,关节机械加载为治疗肥胖提供了一种新的物理康复手段。

3.2 机械加载治疗对肥胖引起骨量流失的改善作用 肥胖的主要特征是大量脂肪组织的堆积,除了在内脏和皮下存储中的积累外,脂肪对于骨骼的影响也是值得关注的。肥胖与骨稳态之间的关系十分密切,有证据表明,肥胖的人发生骨折的风险较高,提示脂肪组织可能会对骨骼产生负面影响[3]。本研究中,高脂饮食导致了股骨的骨量流失显著增加(骨密度降低和骨量降低),而机械加载治疗有效减少了肥胖小鼠的骨量流失,本研究结果与Hafner 等[20]研究结果相一致,该研究认为高脂饮食能够诱导肥胖和脂肪组织炎症,并导致骨质流失和骨髓脂肪堆积,对骨骼造成不良影响[20]。然而,膝关节加载治疗通过改善骨小梁缺失和减少股骨内脂肪堆积来缓解肥胖引起的骨量流失。表明膝关节加载改善了肥胖相关的骨丢失,为治疗肥胖引起的骨代谢异常提供了新的策略。

3.3 机械加载治疗对成骨细胞和脂肪细胞的影响 由于骨髓脂肪组织的积累[21],肥胖引起的骨质疏松症的特征是小梁骨中的骨髓脂肪增加和BMD降低[22]。骨髓中脂肪组织的增加可能与间充质干细胞向脂肪细胞和成骨细胞分化的失衡有关[5],其中间充质干细胞向成骨细胞的分化可以减轻骨质流失[23]。C/EBPα 和PPARγ 是脂肪分化的关键转录因子[24],而RUNX2作为调节成骨细胞生成基因的主要开关[24],ALP 则是一种与类骨素形成和矿化有关的糖蛋白[25]。同时,本研究结果也表明长期高脂饮食导致脂肪生成相关蛋白(C/EBPα 和PPARγ)的表达升高,成骨细胞生成相关蛋白(RUNX2和ALP)的表达降低。膝关节负荷抑制了C/EBPα和PPARγ的表达,并促进了RUNX2和ALP的表达。这些观察结果表明,机械负荷通过抑制脂肪细胞生成并促进成骨细胞分化来改善肥胖引起的骨量流失。

3.4 不足与展望 随着我国肥胖人口的逐年增加,肥胖引起的多种相关代谢性疾病也越来越多。传统的药物价格昂贵,而且会存在一定的不良反应。因此,找到一种安全有效的治疗方式是目前所面临的重大问题。本实验表明,机械加载可作为一种新型的物理治疗手段,通过促进成骨细胞生成和抑制脂肪细胞来改善高脂饮食引起的肥胖性骨流失,为机械加载对肥胖和肥胖性骨质流失的治疗手段和临床实践提供了实验参考。在未来的研究中,我们将进一步探究机械加载对肥胖相关骨丢失的潜在分子机制。

猜你喜欢
小梁骨量高脂
吃高脂鱼类可防癌
营养影响骨骼强度
补 缺
补缺
补缺
鱼油可减轻高脂饮食的危害
微商
高脂饮食诱导大鼠生精功能障碍
味精与高脂日粮对生长猪胴体性状与组成的影响
武术运动员退役前后骨量丢失的身体部位及年龄特征