脂肪干细胞来源外泌体携带miR-27抑制白色脂肪的棕色化

钟琼慧，黄波，卢婉，徐颜美，闵清华，李书琪，姜钰环，林晋△，王小中△

肥胖及其相关疾病的发病率逐年上升，成为全球不可忽视的一大问题。白色脂肪组织（white adi⁃pose tissue，WAT）的过度聚集是导致肥胖的直接原因之一［1］。WAT 与棕色脂肪组织（brown adipose tis⁃sue，BAT）是共同存在于哺乳动物体内的2种脂肪组织，前者通常以三酰甘油的形式储存能量，而后者则通过解偶联蛋白1（uncoupling protein 1，UCP 1）介导的非寒战形式产生热量［2］。研究发现，WAT 可以向BAT转换，拮抗肥胖的产生，这种转变称为白色脂肪棕色化，在这过程中过氧化物酶体增殖剂激活受体γ（PPARγ）、含PR结构域的锌指蛋白16（positive reg⁃ulatory domain zinc finger protein 16，PRDM16）及过氧化物酶体增殖子激活受体γ 共激活因子1α（per⁃oxisome proliferators-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）是最核心的调控因子［3-4］。外泌体作为一种存在于机体几乎所有微环境中的新兴的功能性物质，能够通过携带蛋白质、信使核糖核酸（messen⁃ger ribonucleic acid，mRNA）、微小核糖核酸（microribonucleic acid，miRNA）等生物活性分子释放到微环境中，充当细胞间信息交流的中介，参与调节多种细胞生物学功能［5］。本研究旨在探讨脂肪干细胞来源的外泌体通过携带高浓度miR-27 抑制白色脂肪棕色化的作用机制，以期为肥胖的研究及治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级雄性Balb/C小鼠3只，体质量18.6～20.1 g，4周龄，由湖北省动物研究中心提供，用于分离培养脂肪干细胞（ASC）；SPF 级雄性C57BL/6 小鼠18 只，体质量14.9～17.6 g，购自江西中医药大学实验动物中心，3周龄，用于构建肥胖模型及后期实验。饲养环境均为温度22～26 ℃，相对湿度50%～60%，人工光照明暗各12 h。人胚肾细胞系293T 细胞株，购自中国科学院细胞库。低糖DMEM培养基（Hyclone公司），Ⅰ型胶原酶（Gibco 公司），多聚赖氨酸（Sigma 公司），流式检测抗体CD34、CD45、CD105、CD133及Sca-1（eBioscience公司），质粒提取试剂盒（OMEGE 公司），T4 DNA 连接酶（TAKARA 公司），内切酶BamHⅠ、内切酶XbaⅠ（NEB 公司），Lipofectamine2000 转染试剂盒（Invitrogen 公司），Western blot 抗 体 UCP1、PPARγ、PRDM16 及 PGC-1α（Bioswamp公司），倒置荧光显微镜（Leica公司），流式细胞仪（艾森公司），实时荧光定量核酸扩增（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪、水平电泳设备、凝胶成像系统（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 脂肪干细胞的分离培养及鉴定 SPF级雄性Balb/C小鼠3只,普通饮食，不经特殊处理，断颈处死小鼠，于75%乙醇中浸泡15 min，无菌条件下分离双侧腹股沟脂肪组织。将收集的脂肪组织剪碎后置于50 mL的离心管内，加入适量的氯霉素，15 min 后用2～3 倍体积的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次。1 000 r/min 离心5 min 后弃上清，加入5 倍体积的0.1%胶原酶NB4，将离心管置于37 ℃恒温汽浴摇床内消化2 h，150目无菌网筛滤去未被消化的残余组织。接着1 000 r/min离心5 min 弃上清，细胞沉淀用PBS 洗涤2 次，将收集的细胞用培养液重悬，以1×105个/cm2的密度接种于培养皿内。置于培养箱中培养，每3 d 换液，待细胞生长达到90%融合时，消化传代。收集第3代细胞进行形态、表型的鉴定：倒置相差显微镜下（×40、×100、×200）观察细胞的生长及形态学特点；用流式细胞仪检测细胞CD34、CD45、CD105、CD133 及Sca-1抗原的表达。

1.2.2 外泌体的提取与鉴定 取第3 代ASC 细胞用低糖DMEM 培养液于5%CO2、37 ℃饱和湿度温箱中进行扩增培养，所用胎牛血清在使用前均经110 000×g超高速离心18 h以去除可能存在于血清中的外泌体。收集120 mL细胞培养24 h后的培养液，依照差次梯度超高速离心法提取外泌体［6］。提取的外泌体用PBS溶液重悬后于-80 ℃保存备用。外泌体的鉴定包括透射电子显微镜观察外泌体形态以及Western blot 技术检测外泌体标志蛋白Alix 和TSG101 的表达（重复3次上样）。

1.2.3 过表达miR-27载体的构建 目的基因序列通过基因合成的方法获取，将合成的DNA 片段及载体分别用内切酶BamHⅠ、内切酶XbaⅠ于37 ℃双酶切3 h；双酶切后目的基因片段与载体进行连接，16 ℃连接过夜，待长出菌落，挑取单个菌落，摇菌提取质粒DNA。取对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为1.0×106个/mL，37 ℃、5%CO2培养箱内培养，24 h 待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。转染24 h 后更换培养基，48 h 和72 h 分别2 次收集病毒上清，收集后以0.45 μm滤器过滤，上清液加浓缩试剂（慢病毒液体积∶浓缩试剂体积=5∶1）4 ℃孵育过夜。完成孵育后，混合液于50 mL 超速离心管中4 ℃、3 500×g离心25 min。弃去上清，根据收集的慢病毒上清液体积，1/100～1/10体积的PBS重悬病毒沉淀，分装后置于-80 ℃保存备用。

1.2.4 荧光显微镜验证转染效率及qRT-PCR 验证miR-27表达量 慢病毒上清感染293T细胞，分为3组：对照组（不进行感染）、空载体组（加入空载体）及慢病毒过表达组（加入构建的过表达miR-27载体），48 h后在荧光显微镜下观察转染效率，以转染效率最好的病毒液浓度作为最佳的病毒转染滴度，计算病毒滴度=病毒颗粒数/病毒原液量。培养生长良好的ASC 细胞24 h 后，取病毒液以最佳滴度感染ASC，培养48 h后收集培养液，提取获得过表达miR-27的外泌体。提取总RNA，利用qRT-PCR 检测miR-27 的表达量。按表1 序列进行引物构建，反应过程：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 5 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 25 s，39个循环；72 ℃延伸7 min。

Tab.1 Primer sequences of miR-27 and internal reference U6表1 miR-27及内参U6的引物序列

1.2.5 动物实验 C57BL/6 小鼠18 只在适宜的环境中普通喂食。适应7 d后，每2 d以含45%脂肪饲料喂食。喂养8周构建肥胖小鼠模型，并记录体质量，以肥胖度大于＞20%为造模成功［7］。将肥胖小鼠随机均分为3组，每组6只：通过尾静脉分别注射过表达miR-27 ASC 细胞分泌的外泌体（过表达组）、正常ASC 细胞外泌体（正常表达组）及生理盐水（对照组），每2 d注射1次，共12 d；这期间3组继续以高脂肪喂食6 d记录体质量，第7 d开始予以普通喂食，并且每天给予寒冷刺激1 h。第12 天记录体质量后，分离小鼠附睾皮下脂肪组织（即WAT）和肩胛骨脂肪组织（即BAT），检测UCP1、PPARγ、PRDM16、PGC-1α的表达情况。

1.2.6 Western blot 检测UCP1、PPARγ、PRDM16、PGC-1α 的表达 配制12%的分离胶、5%的浓缩胶。每孔上样量为20 μg 蛋白。电泳：80 V 40 min，120 V 50 min，当染料到达胶底部时即终止电泳，260 mA转膜120 min（转膜前将膜在甲醇中浸泡5 min）；5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗室温孵育1 h或4 ℃孵育过夜；洗涤3次，每次5 min。随后根据用量，按照1∶10 000 稀释二抗，与膜室温孵育1 h，洗涤3 次，每次5 min。之后进行ECL化学发光检测，通过TANON GIS软件读取相关条带灰度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 24.0统计学软件分析数据。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析和重复测量的方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ASC细胞的形态观察与鉴定 ASC刚贴壁的细胞呈圆形，培养24 h后细胞呈长梭形；培养第3代的ASC 的形态，见图1。流式细胞仪检测显示，CD34、CD45、CD133 低表达，阳性率分别为6.43%、6.35%、0.09%；CD105 与 Sca-1 高表达，阳性率为 93.71%、92.62%，见图2。

2.2 外泌体的鉴定 分离的外泌体透射电镜下呈囊泡状，大小为30～120 nm，见图3A；Western blot 检测示，提取物表达外泌体标志蛋白Alix 和TSG101，见图3B；qRT-PCR 检测示，脂肪干细胞（5.65±0.78）及脂肪干细胞外泌体（5.26±0.67）中miR-27 表达量高于白色脂肪组织（1.00±0.02），差异有统计学意义（n=3，F=56.661，P＜0.001）。

2.3 miR-27转染效率 慢病毒转染293T细胞48 h后，当病毒滴度为5×108TU/mL 时，光学显微镜下显示细胞生长良好（图4A、B、C），荧光显微镜下显示慢病毒密度高（图4D、E），以此滴度为病毒最佳转染滴度。转染ASC 细胞后的对照组、空载体组及过表达组的 miR-27 的表达量分别为（1.00±0.02）、（1.02±0.02）、（39.68±0.31），差异有统计学意义（n=3，F=44 357.091，P＜0.001）。

2.4 外泌体携带miR-27对小鼠体质量与脂肪组织体积的影响 过表达miR-27 对小鼠的体质量变化无明显影响，相同时点3 组间的体质量组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。3组干预后12 d的小鼠体质量与干预前的体质量的减少量分别为：对照组（3.32±1.36）g、过表达组（1.12±0.43）g、正常表达组（1.75±0.31）g，组间差异有统计学意义（F=10.878，P＜0.01）。相对于对照组，过表达组与正常表达组小鼠分离的WAT 体积要大，且过表达组更明显；而BAT的大小变化不明显，见图5。

Tab.2 Changes in body weights of three groups of mice表2 各组小鼠体质量变化情况 （g，）

Tab.2 Changes in body weights of three groups of mice表2 各组小鼠体质量变化情况 （g，）

F时间=69.108，F交互=7.370，P＜0.05；F组间=0.628，P＞0.05

组别对照组过表达组正常表达组n6 6 6干预前30.82±2.44 29.93±3.02 31.48±3.25注射后6 d 29.60±2.00 29.25±2.49 31.03±3.25注射后12 d 27.50±1.35 28.82±2.80 29.73±3.30

2.5 外泌体携带miR-27对UCP1、PPARγ、PRDM16及PGC-1α 的影响 对照组、正常表达组与过表达组的UCP1、PPARγ、PRDM16及PGC-1α相对表达水平呈依次降低趋势（P＜0.05），见表3、图6。

Tab.3 Comparison of expression levels of UCP1,PPARγ,PRDM16 and PGC-1α between the three groups表3 各组小鼠中UCP1、PPARγ、PRDM16、PGC-1α的表达水平比较 （n=3，）

Tab.3 Comparison of expression levels of UCP1,PPARγ,PRDM16 and PGC-1α between the three groups表3 各组小鼠中UCP1、PPARγ、PRDM16、PGC-1α的表达水平比较 （n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a 与对照组比较，b 与正常表达组比较，P＜0.05

组别对照组正常表达组过表达组F UCP1 0.61±0.01 0.59±0.01a 0.30±0.02ab 663.946＊＊PPARγ 0.77±0.02 0.66±0.01a 0.35±0.02ab 535.571＊＊PRDM16 0.37±0.02 0.33±0.01a 0.23±0.01ab 75.941＊＊PGC-1α 0.50±0.01 0.38±0.01a 0.26±0.01ab 534.125＊＊

3 讨论

WAT被认为是一种复杂的内分泌器官，通过产生多种脂源性细胞因子调节复杂的生理过程，维持系统能量平衡［8］。BAT主要生理学功能是产生和释放热量，对维持机体能量平衡也有重要作用［9］。ASC来源的外泌体内含大量的遗传信息，通过自分泌或旁分泌的方式对邻近或远处的靶细胞发挥其调控作用［10］。因此，如何调控外泌体的产量及控制其携带的遗传信息对WAT的影响，对于理解白色脂肪棕色化的进程及肥胖控制有至关重要的意义。

miRNA 可以从供体细胞传递到远端的受体细胞，以内分泌或旁分泌的方式向特异靶组织细胞传递调节信号，改变靶组织某些基因的表达，因此其可以作为疾病诊断的生物标志物［11］。笔者团队前期也证实了ASC 富含微囊泡（包括外泌体），且携带丰富的miRNA，具有促进血管生成、肿瘤发展的生物学作用［6］。有研究表明miR-27 在抗肿瘤方面的作用也不可小觑，包括诱导食管癌、肝癌、胃癌、胰腺癌细胞凋亡［12］，抑制肺癌细胞增殖［13］，参与前列腺癌、乳腺癌、淋巴瘤的疾病进展等，这提示miR-27 可能成为治疗或预防肿瘤的靶标，而ASC 来源的外泌体可能成为未来攻克肿瘤难题的新方向。

研究显示，miR-27 可以直接抑制PPARγ 基因，影 响 线 粒 体 功 能［14］；miR-27 通 过 靶 向 调 节PRDM16，进而参与脂肪棕色化调控［15］。同时有研究发现miR-27a/PPARγ/β-catenin 轴激活也可促进糖尿病肾病的发展，主要是引起足细胞损伤，使血流动力学因子改变，刺激系膜细胞胞外基质的合成增加［16］。在脂肪细胞分化过程中，miR-27能够直接靶向结合抗增殖蛋白（prohibitin，PHB），引起线粒体结构变化及功能障碍，从而抑制脂肪细胞的分化［17］。由此可见，miR-27可以在多位点参与调控脂肪代谢过程，具有调控白色脂肪棕色化的潜能。但关于外泌体这一具有生物传导的活性物质，却鲜有研究其中的miR-27 的含量及其对脂肪组织转化、代谢的作用。

研究显示，肥胖状态下血清中升高的miR-27主要来源于脂肪细胞分泌［18］，且通常作为一种负向调控因子来抑制脂肪细胞分化［19］。本研究结果显示，ASC 及其外泌体中的miR-27 显著高于WAT，证实ASC 可能是研究miR-27 功能与机制的良好材料来源。另有研究认为，肥胖小鼠中的WAT 中miR-27含量下降，而体循环中miR-27 则呈现上调趋势［18］。本研究同样发现此种现象，这可能与脂肪干细胞分泌外泌体并携带miR-27进入体循环有关，进而影响或调控脂肪的代谢。以往研究发现，miR-27主要靶向PPARγ 的表达来抑制脂肪沉积［20］。而本研究发现，miR-27 可以抑制PPARγ 的表达，但主效应是抑制白色脂肪向棕色脂肪转变，使得白色脂肪消耗减少，呈现出肥胖小鼠体质量下降缓慢。小鼠WAT体积增大，这可能与miR-27 对其他棕色化相关蛋白（UCP1、PRDM16、PGC-1α）的抑制作用更强有关，对BAT合成的抑制作用强于WAT的消耗。

综上所述，miR-27能够由ASC以外泌体形式分泌，且能够被脂肪细胞所摄取；ASC以外泌体形式分泌的miR-27能够抑制白色脂肪棕色化，该抑制作用主要通过转运miR-27 下调UCP1、PPARγ、PRDM16及PGC-1α棕色化相关蛋白的表达完成。