TLR4调控自噬与肾脏疾病的研究进展

易扬，谢恺庆

据估计，全世界有8.5 亿人因各种原因罹患肾脏疾病，该病作为一个世界性的公共卫生问题越来越受到关注。随着经济的快速增长和生活方式的逐步改变，中国面临着日益加重的肾脏疾病的负担［1］。有研究表明，炎症在肾脏疾病的发生发展中起关键作用，肾脏固有细胞急性损伤后所诱发的炎症瀑布是急性肾损伤加重的主要原因，而肾脏细胞慢性损伤所触发的慢性炎症导致肾间质过度纤维化是肾功能进行性恶化的主要原因［2］。Toll 样受体 4（Tolllike receptor 4，TLR4）被内源性或者外源性配体激活后可诱导炎症的产生，同时也可引起胞浆微管相关蛋白1 轻链3（LC3）的聚集（自噬体形成的标志）；TLR4 激活自噬受髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）或含 TIR 结构域的转接蛋白（TIR-domain-containing adaptor protein including IFN-β，TRIF）与 Beclin1（自噬早期标志物）相互作用所调控［3-4］。有研究显示，TLR4 调控的自噬参与包括脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）所致肾损伤、肾缺血性再灌注损伤、糖尿病肾病、顺铂所致肾损伤、乙肝所致肾损伤等多种肾脏疾病的发生发展［5-6］。因此深入探索肾脏疾病的自噬调控机制，寻找治疗或者延缓肾脏疾病进展的方法具有重要意义。本文将从TLR4 介导自噬异常与肾脏疾病的研究进展做一综述。

1 自噬

自噬现象是20 世纪60 年代科学家Ashford 和Porter 用电子显微镜在人的肝细胞中首次被发现［7］。自噬及自噬异常相关疾病的机制是目前医学界的研究热点。自噬与神经退行性疾病、癌症、感染和炎性肠病等多种疾病的发病机制密切相关［8-10］。自噬主要分为起始、囊泡成核、延伸和融合3 个阶段。自噬的起始ULK1/ATG1 复合物（自噬启动复合物），其哺乳动物同源蛋白命名为ULK1，在酵母中命名为自噬相关基因1（ATG1）。ATG6（哺乳动物同源蛋白命名为Beclin1）的复合物是细胞自噬过程中最重要的正性调节因子，也是自噬小泡成核所必需的，Beclin1及其上下游信号调节蛋白组成重要的自噬调节通路。Beclin1 调节细胞自噬主要通过BH3 结构域与Bcl-2 基因的相互作用来实现。在自噬小泡核化的初级阶段激活Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）需要依赖于多蛋白复合物的形成；在成核后吞噬受损的细胞器与大分子物质形成自噬体，称为自噬小体（autophagosome），完整的自噬小体沿着微管转运，将其内容物传递到溶酶体内降解形成自噬溶酶体。随后，溶酶体酶降解自噬体的内容物可以用于合成新的蛋白质、细胞器及能量。

2 TLR4信号通路

TLR4 是最早被发现在人类细胞表面的TLRs蛋白，1997 年被 Medzhitov 等［11］首次发现，在先天性免疫应答中扮演着不可或缺的角色。TLR4 可特异性识别来源于细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原相关分子模式（PAMPs），也可识别来源于肿瘤、坏死或凋亡的细胞释放的内源性损伤相关分子模式（DAMPs），并与之结合，进而激活TLR 信号转导通路诱发相关炎症级联反应。TLR4 和骨髓分化因子2 作为共同受体来识别其配体，并与配体相结合后激活 TLR4/CD14/MD2 复合物，活化的TLR4 胞内TLR 样结构域与MyD88 的羧基端结合，继而激活肿瘤坏死因子受体相关分子6 和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），然后在早期激活核转录因子-κB（NF-κB），促进细胞因子的表达和炎症反应的产生；或者TLR4 通过 TRIF/TICAM-1 和 TRIF/TICAM-2 激活晚期的NF-κB，同时激活TRIF-TBK/IRF3 信号通路引起Ⅰ型干扰素的释放，以及诱发免疫系统的调控性应答［12-13］。TLR4 既可以激活依赖性 MyD88 信号通路，也可激活TRIF 信号通路，依赖/非依赖性途径最终均可活化NF-κB 和MAPK 信号通路，诱导炎性因子的表达，进而促进抗病毒及抗细菌免疫。

3 TLR4信号通路调控自噬

3.1 TLR4 调控自噬 早期研究将自噬与天然免疫联系起来，认为这是宿主对多种细胞内病原体的防御反应［14］。在感染过程中自噬的调控过程是复杂的，由许多受体介导，TLR4 可识别病原体的特定分子模式，在天然免疫和适应性免疫中起着重要作用，是第1 个被证明参与自噬过程的受体。自噬是一种细胞对饥饿的反应，可以将受损的细胞器和长寿的蛋白质从细胞质运送到溶酶体来清除。然而，多种免疫和炎症信号通过TLR4 介导自噬异常［15］，若诱发自噬增强不足或被抑制则引起宿主细胞自我保护作用削弱，致细胞受损及触发炎症反应；若诱发自噬过度增强则触发宿主细胞凋亡。有研究表明TLR4的信号转导诱导炎症产生的同时也诱导细胞的自噬小体形成明显增多［16-17］。

3.2 TLR4-MyD88 的信号通路调控自噬 TLR4 下游通路蛋白 MyD88 直接或间接将Beclin1 引入TLR4 信号复合物中，可减少Beclin1 和Bcl-2 之间的相互作用，诱导Beclin1 的泛素化，导致Bcl-2 释放Beclin1 启动自噬体的形成。TRAF6 可激活NF-κB 从而诱导炎性因子的产生，是TLR4-MyD88 信号通路中的关键分子。通过招募Beclin1 并诱导Beclin1 的泛素化后可激活自噬。磷酸化的UNC-51样激酶 1（UNC-51-like kinase 1，ULK1）一直以来被认为是自噬的一个关键调控因子，自噬溶酶体组装前，自噬信号是通过由 mAtg13、FIP200（酵母中Atg17 的同系物）、ULK1（酵母中 Atg1 的同系物）3种蛋白形成的ULK1 复合物的活化介导的。在体内ULK1 复合物是连接上游营养或能量感受器雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）与下游自噬体形成的桥梁，泛素化TRAF6也可激活ULK1 而促进自噬。近期研究表明，在七氟醚治疗老年大鼠模型中，雷帕霉素可通过TLR4-MyD88 信号通路减轻脑组织损伤和激活自噬的产生［18］。

3.3 TLR4-TRIF 信号通路调控自噬 细菌感染会引发自噬和炎症的激活，相关研究已经证明，铜绿假单胞菌感染可通过TLR4-TRIF 信号通路激活自噬［19］。朊病毒病是一种神经退行性疾病，其特征是朊蛋白的错误折叠、脑内海绵状改变以及小胶质细胞广泛激活引起的脑炎症。NALP3 炎症小体是一种多蛋白复合物，是先天免疫系统的组成部分，可以调控细胞释放促炎细胞因子。Lai 等［20］在首次探讨朊病毒病中炎症与自噬的相互调节作用时，发现自噬可抑制经朊蛋白片段106-126（PrP106-126）处理的小胶质细胞中NALP3 炎症小体的激活，同时也抑制随后的 caspase-1 裂解和白细胞介素（IL）-1β 的释放，而NALP3 炎症小体通过激活caspase-1 裂解TRIF 限制自噬。TLR4 或 TRIF 基因敲除抑制PrP106-126 诱导小胶质细胞中的自噬，提示TLR4-TRIF 信号通路参与PrP106-126 诱导的自噬。自噬和炎症反应之间的关系在创伤性脑损伤（TBI）后继发性脑损伤中起着重要作用。在大鼠TBI 模型中，TAK-242 可显著降低 TBI 诱导 TLR4、Beclin1 和LC3-Ⅱ的表达水平，并维持24 h 内P62 表达水平无明显变化。通过蛋白质印迹分析表示，TLR4 下游信号分子 TRIF、NF-κB、肿瘤坏死因子（TNF）-α 和IL-1β 在海马组织中的表达显著下调。有研究表明，TLR4/TRIF 信号通路可参与调控海马神经元自噬［3］。Gao 等［21］研究发现 TLR3 基因的敲除可通过TLR3-TRIF 抑制自噬，减轻小鼠心肌梗死面积，减轻心力衰竭并改善生存率［21］。

3.4 NF-κB 调控自噬 NF-κB 被认为是调控炎症相关基因诱导的主要转录因子，在细胞增殖、免疫应答、应激反应、炎症和凋亡等多种细胞活动中发挥重要作用。在人类中，至少有5 名NF-κB 家族成员，包括 NF-κB2（P52）、NF-κB1（P50）、RelB（relb 原癌基因，NF-κB 亚基）、c-rel（relto-原癌基因，NF-κB亚基）和 rela（rela-原癌基因，NF-κB 亚基，P65）［22］。NF-κB 介导的炎症与自噬之间相互作用、相互依赖［23-24］。NF-κB 活化可以抑制细胞自噬水平。TRAF6 作为NF-κB 信号转导通路中的信号转导元件，可被TLR4 激活而产生，也可诱导自噬关键蛋白Beclin1 泛素化。然而，Beclin1 泛素化被一种NF-κB 抑制剂 A20 所抑制，导致自噬被抑制［25］。肿瘤坏死因子激活的NF-κB 通过激活mTOR 和抑制活性氧的积累，从而抑制自噬的发生［26］。然而，在另一些情况下，NF-κB 活性又可以增强细胞自噬水平。在热休克后的恢复期内，NF-κB 转录因子被激活，可以通过调节自噬体的成熟诱导自噬，对热休克后的细胞存活有至关重要的作用。NF-κB 与Beclin1基因启动子上的NF-κB 的结合位点结合，从而激活自噬的产生［23］。

4 TLR4调控自噬与肾脏疾病的关系

4.1 LPS 所致肾损伤 脓毒症相关的急性肾损伤（acutekidney injury，AKI）最常见的致病因素是脓毒症。在成人和儿童的研究数据中，脓毒症占发达国家所有AKI 的26%～50%，而在原发性肾脏疾病相关的 AKI 中占 7%～10%［27］。LPS 是革兰阴性脓毒症时释放的一种免疫原性细菌细胞壁成分，TLR4 是LPS 的主要受体。Leventhal 等［28］通过腹腔注射 LPS建立化脓性AKI 小鼠模型，结果显示，TLR4 基因缺失的 C57BL/10SCN 小鼠注射 LPS（15 mg/kg）24 h后，肾皮质LC3-Ⅱ积累与对照组（注射生理盐水）无明显差异。分离原代肾皮质的肾小管上皮细胞，并将其在合适的培养基中培养24 h 后，进一步证实TLR4 在LPS 诱导肾小管上皮细胞自噬的作用。该研究表明，LPS 不能诱导来自C57BL/10SCN 小鼠的肾小管上皮细胞自噬；首次证明LPS 是依赖于TLR4 信号通路诱导人肾小管上皮细胞的自噬。该研究还采用肾小管特异性自噬蛋白7（ATG7）基因缺失的小鼠模型，确定了自噬对LPS 诱导的AKI 的肾小管具有保护作用，从而确定自噬是防治脓毒性AKI 的新靶点。Zhao 等［29］研究显示，LPS 可通过TLR4-MyD88 途径诱导巨噬细胞中炎性因子TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的表达上调；同时显著提高 LC3B和Beclin1 的表达水平；且研究表明熊果酸（UA）可通过TLR4/MyD88 途径增强巨噬细胞自噬从而预防LPS 导致的肾损伤。

4.2 肾缺血再灌注损伤 缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是造成 AKI 第二大原因，常见于各种原因导致的失血、休克、器官移植等过程中。IRI 所致的肾损伤能够造成组织器官发生不可逆的损伤，包括血管内皮细胞功能障碍、炎症和肾小管细胞损伤［30］。TLR4 在肾脏组织中高表达，并且还可通过TLR4-MyD88 信号通路参与肾IRI 的过程［31］。Poluzzi 等［32］研究显示，肾 IRI 小鼠在 IRI发作时，TLR4 缺乏和CD44 缺乏小鼠巨噬细胞中Biglycan（富含小亮氨酸的双糖链蛋白聚糖）所诱导的LC3-Ⅱ、P62 表达水平被显著抑制。共聚焦显微镜下可见TLR4 缺乏和CD44 缺乏小鼠巨噬细胞中自噬水平降低。此研究结果提示Biglycan 可通过TLR4 与CD44 相互作用激活巨噬细胞中的自噬，从而减少肾脏炎症及损伤。因此TLR4 调控自噬在缺血再灌注所导致的AKI 中具有重要作用，但具体机制有待进一步证实。

4.3 糖尿病肾病 糖尿病肾病是糖尿病全身微血管病变的肾脏表现，也是糖尿病最常见且最影响其预后的慢性并发症［33］。研究已证实，糖尿病最终发展为终末期肾衰竭的主要原因之一是由糖尿病引起的慢性炎症反应，而TLR4 激活的信号转导通路与这种炎症反应有关［34］。Xu 等［35］在体外采用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）处理肾小管上皮细胞模型，抑制TLR4 表达后LC3-Ⅱ表达水平降低，P62 表达水平增高。研究结果提示TLR4 可参与调控ox-LDL诱导肾小管上皮细胞的自噬。Wang 等［36］研究表明，在糖尿病患者肾组织足细胞内基因敲除MyD88 后可下调LC3-Ⅱ的表达，但上调P62 和p-mTOR 的表达，然而敲除TRIF 基因对这些蛋白质的表达无明显影响。研究结果提示TLR4-MyD88 信号通路参与诱导足细胞自噬。足细胞损伤是糖尿病肾病中肾小球硬化和蛋白尿的主要发病机制。足细胞的基底自噬率在所有肾细胞中最高，因此这种自身修复机制对足细胞来说尤其重要［37］。

4.4 顺铂所致肾损伤模型 顺铂具有明显的肾毒性，是一种常用的化疗药。大量研究已经证实，顺铂可激活肾小管上皮细胞自噬［38-39］。肾小管上皮是肾损伤的重要靶点，并且对肾毒素和缺血再灌注引起的肾损伤更敏感，更易激活自噬。相关研究表明，TLR4 在顺铂所致肾损伤进展中起着不同的作用。TLR2 和TLR4 在肾脏组织中高度表达，并参与顺铂诱导的 AKI［40］。Shen 等［41］采用顺铂诱导肾损伤小鼠模型，研究结果表明TLR2 可促进PI3K/Akt 磷酸化，增强肾小管上皮细胞的自噬，对顺铂诱导的AKI具有保护作用，而TLR4 在顺铂所致肾损伤进展中起着不同的作用。Andrade-Silva 等［6］采用腹膜内注射顺铂诱导的AKI 小鼠模型，将其分为顺铂组、顺铂+TLR4KO（TLR4 的基因敲除）组、顺铂+TLR2KO（TLR2 的基因敲除）组，顺铂+TLR2KO 组小鼠的自噬相关分子（即LC3 和ATG5）表达水平低于顺铂+TLR4KO 组；与顺铂组相比，缺乏TLR2 会导致严重的肾组织损伤，而缺乏TLR4 可防止小鼠肾组织的损伤；研究结果提示TLR4 可通过依赖性MyD88 信号通路及TRIF 信号通路激活自噬；因此在肾损伤时TLR4 可通过TRIF 信号通路产生不同于TLR2激活自噬时的反应。

4.5 乙肝所致肾损伤 我国是乙型肝炎大国，AKI是终末期肝病最常见的并发症之一［42］。张晓田等［43］研究表明，乙型肝炎病毒（HBV）感染致肾损伤中也有自噬信号异常激活，采用HBV 感染患者的血清感染人肾小管上皮细胞系，并进行体外培养和TLR4 靶向干预实验，发现HBV 感染组的LC3-B 和Beclin1 表达水平升高，P62 表达水平降低，提示HBV 感染可激活肾小管上皮细胞的自噬，这可能是一种自我保护机制。进一步研究发现，激活TLR4/NF-κB 信号通路后自噬水平加强，而抑制TLR4/NF-κB 信号通路后自噬水平有所减弱，证明通过靶向干预TLR4 能够调控HBV 感染肾小管上皮细胞的自噬。

5 结论与展望

自噬是真核细胞中高度保守的细胞生理性活动过程，在生理情况下，自噬参与维持细胞稳态，广泛参与到多种细胞重要生理过程的调控。肾损伤时，自噬可吞噬破裂的溶酶体以及恢复溶酶体功能，以防止细胞损伤；还可通过抑制炎症小体的活性，同时清除受损细胞器并对炎症反应进行调节，以防炎性因子的产生。近年来TLR4 调控自噬与肾脏疾病中的作用已经受到研究者的广泛关注，但目前其具体机制尚无定论。在不同原因导致的急慢性肾损伤中均有研究报道显示TLR4 激活自噬对肾损伤发挥保护作用；然而在顺铂导致肾损伤模型中，TLR4 可介导自噬异常从而加剧肾小管损伤并对肾脏功能造成影响。目前在肾脏疾病中TLR4 调控自噬双重作用尚未完全阐明，涉及的具体信号通路调控机制有待进一步探索。阐明在肾脏疾病中TLR4 调控自噬的发生机制和作用，并加以合理的干预和利用，开发调控自噬的药物，可为临床寻找延缓或防治肾脏疾病提供精确的治疗靶点。