采用体内实验探讨IL-17A促进卵巢癌腹腔种植瘤顺铂耐药的机制

陈燕，牛秀珑，郁春艳，李岩，邓为民△

白细胞介素-17（IL-17）家族由6 个细胞因子（IL-17A～F）和5个受体（IL-17RA～RE）组成，其中IL-17A（通常也称为IL-17）是IL-17 家族中研究最广泛，同时也是最具代表性的细胞因子［1］。辅助性T细胞（Th17）是IL-17A的主要来源，除了Th17细胞，自然杀伤T细胞、γδT细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞也可以分泌IL-17A［2-3］。卵巢癌（OVCA）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，在肿瘤早期缺乏特异性诊断，转移快、病因复杂，多数患者就诊时已进入中晚期，病死率很高。研究表明，在卵巢癌的富脂微环境中聚集着大量的IL-17A，后者可通过加速肿瘤迁移、侵袭和血管生成在OVCA进展中发挥关键作用［4-5］。

目前，手术辅助顺铂（DDP）联合紫杉醇的化疗方案是大多数原发性OVCA 患者的有效治疗方法，但化疗耐药的产生使卵巢癌的预后不佳。患者5年的生存率仅为30%左右。因而，OVCA 成功治疗的主要挑战之一是克服多药耐药（MDR）［6-7］。乳腺癌耐药蛋白（ABCG2）是ATP结合盒转运蛋白超家族的一员，它可将进入细胞内的化疗药物泵出，介导肿瘤细胞产生MDR，进而影响肿瘤患者的预后。ABCG2的过表达与DDP耐药的发生密切相关［8］。前期的体外研究结果表明，IL-17A可通过神经胶质瘤相关癌基因1（Gli1）介导的Hh信号通路增加耐药相关基因ABCG2 和 MDR1 的表达水平，从 而 促 进 OVCA 的DDP 耐药［9］。在前期的体外研究的基础上，本文通过建立卵巢癌腹腔种植瘤小鼠模型，探讨IL-17A对卵巢癌腹腔种植瘤DDP 耐药的影响及其影响机制是否与体外研究结果一致。

1 材料与方法

1.1 实验材料 鼠卵巢癌细胞系ID8 细胞由堪萨斯大学医疗生殖中心惠赠；DMEM培养基购自中国南京凯基生物科技发展有限公司；胎牛血清（FBS）购自美国GIBCO公司。24只SPF 级6～8 周雌性C57BL/6 遗传背景的野生型（WT）小鼠由天津医科大学动物中心赠送，24只SPF级C57BL/6遗传背景的IL-17A-/-小鼠购自日本东京理科大学生物医学科学研究所动物疾病模型中心。IL-17A、ABCG2、Gli1、MDR1 抗体购自英国Abcam公司；GAPDH抗体、HRP标记的羊抗兔IgG二抗购自美国Affinity 公司；彩色预染蛋白Marker（11～245 ku）购自美国NEB公司。顺铂（DDP）购自中国山东齐鲁制药公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 ID8细胞用含有10%FBS的DMEM培养基培养，每1～2 d更换培养液并消化传代，培养箱条件为37 ℃，CO2浓度5%，湿度95%。待ID8 细胞生长至对数生长期，消化处理后进行后续实验。

1.2.2 Western blot 实验 Western blot 实验检测小鼠腹腔肿瘤组织中耐药相关分子ABCG2、MDR1 和Hh 信号通路核转录因子Gli1 的蛋白表达情况。用裂解液充分裂解小鼠肿瘤组织，提取总蛋白。SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳，PVDF膜转膜，5%的牛血清白蛋白（BSA）封闭非特异性抗原后，加入相应一抗，4 ℃低速震荡孵育过夜，次日，加入二抗，室温孵育2 h，化学发光成像仪扫描电泳条带，GAPDH为内参，根据目的条带与内参条带比值表示目的蛋白相对表达量。

1.2.3 免疫组化染色 免疫组化染色技术检测小鼠腹腔肿瘤组织中 IL-17A、ABCG2、MDR1 和Gli1 的表达情况。所有标本经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，5 μm厚连续切片，常规脱蜡、水化后，将切片置于0.01 mol/L 柠檬酸钠缓冲液中95 ℃水浴20 min 进行抗原修复，去除内源性过氧化物酶后，进行血清封闭，4 ℃一抗孵育过夜，次日，进行二抗孵育、加显色剂DAB、复染、脱水、封片。实验步骤按试剂盒说明书进行。

1.2.4 小鼠腹腔种植瘤模型构建 将ID8 细胞（5×106个，200 μL）分别注射于6～8周雌性C57BL/6遗传背景的WT小鼠和IL-17A-/-小鼠腹腔内。在ID8 细胞注射后的第4 天，采用随机数字表法将两种荷瘤小鼠分为WT 对照组、IL-17A-/-对照组、WT 治疗组、IL-17A-/-治疗组，每组3 只。治疗组给予DDP（溶剂：生理盐水），腹腔内给药；对照组小鼠以同样方式注射同等剂量生理盐水 1 次。DDP 注射剂量为 4 g/kg［10］，每周给药1次。每日测量小鼠体质量，观察其生长情况、一般状态。连续给药4周和6周后，每组分别颈椎脱臼法处死小鼠3只。计数腹腔及各脏器肿瘤结节生成情况并拍照、计数。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 6 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（）表示。采用单因素方差分析（ANOVA）对不同处理组的肿瘤结节数量、蛋白相对表达量进行统计学分析，组内多重比较采用Tukey检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-17A 对小鼠卵巢癌模型DDP 耐受性的影响 各组治疗4 周和6 周的瘤结节数量差异均有统计学意义（F分别为42.86和35.24，P＜0.05）。WT对照组腹腔内瘤结节数要明显高于IL-17A-/-对照组（P＜0.01）。与WT 对照组相比，WT 治疗组和IL-17A-/-治疗组腹腔内瘤结节的生成减少（P＜0.05）。IL-17A-/-治疗组与WT治疗组相比，腹腔内瘤结节数量显著减少（P＜0.01），DDP 治疗4 周和6 周的结果一致，见图1、2。

2.2 IL-17A 对卵巢癌腹腔种植瘤小鼠DDP 耐药的机制 IL-17A 的表达仅在WT 治疗组中检测到，而在IL-17A-/-治疗组未检测到。WT 治疗组小鼠腹腔肿瘤组织中ABCG2、MDR1、Gli1 水平明显高于IL-17A-/-治疗组，见图3。Western blot 检测结果显示，各组中ABCG2、MDR1、Gli1 水平差异均有统计学意义（F分别为 40.69、57.04 和 60.42，P＜0.05）；WT 对照组 ABCG2、MDR1、Gli1 的表达水平均高于 IL-17A-/-对 照 组（P＜0.05）。 WT 治 疗 组 ABCG2、MDR1、Gli1的表达水平也高于IL-17A-/-治疗组（P＜0.01）。与WT对照组相比，WT治疗组3个蛋白分子表达上调（P＜0.01），而与IL-17A-/-对照组相比，WT治疗组IL-17A-/-治疗组3个蛋白的表达差异无统计学意义，见图4。

3 讨论

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，其转移快、病因复杂、预后很差，严重危害女性健康。目前，对于卵巢癌治疗的常见方案，是以手术为主，辅以放化疗的综合方案，但由于肿瘤细胞对化疗药物易产生耐药性，很多患者治疗达到临床完全缓解后，会出现复发及转移，因此化疗药物耐药已成为晚期卵巢癌患者治疗失败而死亡的主要原因之一［10］。DDP 是一种广泛应用的化疗药物，以DDP 为基础的辅助化疗方案已经应用于多种肿瘤的临床治疗中，DDP 耐药的产生极大地影响了肿瘤化疗的临床效果，其治疗效果往往不尽如人意。

IL-17A是一种多效性细胞因子，可通过调节肿瘤微环境中细胞因子、趋化因子的表达和免疫细胞的数量、活性来促进肿瘤血管生成，是构成肿瘤微环境的重要成分之一，在多种肿瘤的生长和转移中发挥不同的作用。研究显示，Gli1介导的Hh信号通过靶向上皮性OVCA 中的ABC 转运蛋白ABCG2 和MDR1 调控药物敏感性，其潜在机制与Gli1、ABCG2和MDR1基因启动子直接相关［11］。ABCG2和MDR1是ATP 结合盒转运蛋白超家族的一员，可以将细胞内的DDP 泵出细胞外，介导肿瘤细胞产生耐药，影响肿瘤患者的临床疗效。本课题组前期的研究结果表明外源性IL-17A 可通过其受体直接作用于卵巢癌细胞系A2780 和OVCAR3 细胞，通过Gli1 介导的Hh 信号通路增加耐药相关基因ABCG2 和MDR1 的表达水平，从而促进OVCA的DDP耐药［9］。

为了进一步探讨IL-17A 诱导卵巢癌细胞DDP耐药性的发生机制，本研究通过建立腹腔种植瘤动物模型，采用免疫组化染色技术和Western blot方法探讨内源性IL-17A 对卵巢癌DDP 耐药的影响及其影响机制。结果表明，内源性IL-17A可以显著增加小鼠腹腔内肿瘤结节数量。这与本课题组前期的rhIL-17A对A2780和OVCAR3的增殖均无明显作用的体外实验结果相矛盾。这一现象与Tartour 等［12］的研究结果相一致，他们认为IL-17A诱导的肿瘤生长增强与IL-6 在体内表达增加以及肿瘤部位巨噬细胞募集有关。笔者认为造成此结果的一个重要原因是血管生成。肿瘤在体内的生长不仅依赖于自身的生长，还可能与血管生成等其他因素有关［13］。许多研究报道IL-17A可促进肿瘤微环境的血管生成。免疫组化染色和Western blot 结果表明内源性IL-17A 可上调耐药相关分子ABCG2 和MDR1 蛋白表达，且Gli1 的蛋白表达也随着ABCG2 和MDR1 的表达水平的增加而增加，这与体外研究结果一致。

综上所述，内源性IL-17A 可通Gli1 介导的Hh信号通路上调ABCG2和MDR1的表达，进而增强卵巢癌DDP耐药。靶向IL-17A-Gli1信号可能是提高OVCA对DDP耐药的一个新策略。