枇杷叶总黄酮提取及体外抗氧化的研究

廖圆圆，王燕新，郭晓农，蔡德育

(西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

枇杷叶为蔷薇科常绿小乔木植物枇杷EriobotryaJaponica(Thunb.)Lindl.的叶，又名芦桔叶、杷叶[1-2].枇杷在我国绝大部分地区都有种植，但主要分布在江南等地，如江苏、浙江、福建、安徽及云南等[3].目前，枇杷种植目的是采摘果实，而大多数枇杷叶不加以利用，造成了资源的浪费.枇杷叶在一整年内都可以采摘，是一种比较常用的中草药,有利于尿液的排放，能有效地清理肺部，减少咳嗽的次数及能阻止呕吐.目前，国内外从枇杷叶中分离出的活性成分为三萜类、倍半萜类及黄酮类物质[4-5],而枇杷黄酮类化合物具有抗氧化活性、抗癌、抗病毒、抗过敏、抗炎症及保护心脑血管等功能.在本试验的研究中，以抗坏血酸为对照,研究总黄酮对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH)、超氧阴离子、羟自由基清除能力及还原能力的影响，以期为枇杷叶总黄酮的药用和食用开发提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L-抗坏血酸(Vc)，无水乙醇，硫酸亚铁，水杨酸，Tris-HCl，邻苯三酚，磷酸缓冲液，过氧化氢，氢氧化钠，乙二胺四乙酸二钠，铁氰化钾， 三氯化铁，三氯乙酸， 2-硫代巴比妥酸，亚硝酸钠，硝酸铝，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH).试验试剂均为国产分析纯.

1.2 仪器与设备

电子调温电热套(MH3000型)，电热恒温水浴锅(DK-S26型)，微型植物试样粉碎机(FZ102型)，电子天平(YP1201N).

1.3 方法

1.3.1 枇杷叶总黄酮提取工艺

称取枇杷叶干粉50 g，按照1∶10的料液质量体积比在球形烧瓶加入配置好的65%乙醇，重复两次.每一次提取的时间为2 h(从沸腾的时间算起)，浓缩提取液并醇沉，之后过滤浓缩并测定总黄酮含量.

1.3.2 总黄酮定性与含量测定

试管中加入样品提取液，滴加氯化铁溶液，提取液显墨绿色[6]；滴加氢氧化钠溶液，提取液显橙红色[7].有颜色反应说明提取液中含有黄酮类化合物.

芦丁为标样，按文献[8]方法测定总黄酮含量.标准曲线回归方程为y=0.007x+0.011，R2=0.9507.根据方程可以计算总黄酮含量.

枇杷叶总黄酮提取率(%)=(总黄酮量/原料质量)× 100%.

1.3.3 枇杷叶总黄酮的抗氧化活性测定

配制总黄酮质量浓度10 mg/mL的母液，用于抗氧化活性测定.按照使用需要配制成以下浓度，分别是0.000 1、0.001、0.01、0.1、1.0、10 mg/mL6个浓度梯度，待用.抗坏血酸是最具有代表性的抗氧化剂，有很强的抗氧化能力，作为试验的阳性对照.

1.3.3.1 对羟自由基的清除作用

按照实验顺序加入2 mL6 mmol/L的硫酸亚铁，2 mL6 mmol/L水杨酸及2 mL不同浓度的样品溶液，混匀，加2 mL6 mmol/L H2O2在510 nm下测量各浓度的吸光度.空白对照采用的是蒸馏水.羟自由基的清除率是按照下面的公式来计算的.公式中:A0为空白对照液的吸光度；Ax为加入样品溶液后的吸光度；Ax0为无枇杷叶总黄酮和过氧化氢的有机溶液的吸光度.

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清除率(%) =〔A0-(Ax-Ax0)〕/A0× 100%.

1.3.3.2 对超氧阴离子自由基的清除作用

按照顺序50 mmol/LTris-HCl缓冲液(pH 8.2) 4.5 mL，5.0 mmol/L邻苯三酚0.2 mL，1.0 mL不同浓度的样品溶液，蒸馏水2.5 mL，混匀进行反应.在325 nm下测量各浓度的吸光度.10 mmol/L 的盐酸溶液为空白调零组,而空白对照组是用去离子水来替代.对超氧阴离子自由基的清除率是按照下面的公式来计算的.公式中：V1为邻苯三酚在不加抗氧化物质时的自氧化速率，△A/min；V2为邻苯三酚在含有枇杷叶总黄酮(维生素C)中的自氧化速率，△A/min.

清除率(%) =(V1-V2)/V1×100%.

1.3.3.3 还原能力的测定

按照顺序加2 mL样品溶液，磷酸盐缓冲液2 mL，1%铁氰化钾溶液2 mL，混匀进行反应，加入10%三氯乙酸溶液2 mL，摇匀.重新取试管，从原先的试管中取出2 mL原液，加入蒸馏水2 mL,0.1%三氯化铁溶液0.4 mL，反应10 min，于700 nm 波长下测定吸光度值.

1.3.3.4 清除DPPH自由基能力

按照顺序加DPPH有机溶液2 mL，2 mL样品溶液，混匀反应.在517 nm的波长下测定试管中溶液的吸光度值.空白对照用95%的乙醇.DPPH自由基的清除率是按照下面的公式进行计算的.公式中：A0表示的是2 mL DPPH有机溶液+2 mL95%乙醇溶剂的吸光度；A表示的是2 mL样品溶液+2 mL的DPPH有机溶液的吸光度.

清除率(%) =(A0-A)/A0×100%.

2 结果与分析

2.1 对羟自由基的清除作用

羟自由基(·OH)是活性氧中的一种，而且其具有很强的氧化能力.由自由基造成的有害有：过敏、感冒、失眠多梦及疲劳无力等，严重时会造成糖尿病、冠心病、白内障等[9].但加入含有清除自由基的物质之后，就会使发生的有害反应明显降低.·OH主要是在脂质过样化的早期与金属发生螯合而被清除，因此研究生物体内自由基的作用机制，必须对·OH进行检测.在反应中的过氧化氢和亚铁离子混合发生反应，能够生成具有很高反应活性的·OH.水杨酸能够与·OH高效结合，并且生成有色物质.倘若加入具有清除自由基的物质之后，这种物质就会与水杨酸产生强烈的竞争，从而造成羟自由基与水杨酸的反应量的急剧减少，结果就是有色物质的生成急剧减少.在分光光度计上检测其吸光度值低，说明反应生成的有色物质越少，清除率反而越高.因此表示枇杷叶总黄酮对羟自由基的清除能力是清除率的高低.

图1枇杷叶总黄酮对羟自由基的清除率影响

如图1所示，随着质量浓度的逐步增加，对自由基的清除率也会逐渐增加，维生素C对羟自由基的清除效果较枇杷叶总黄酮好.

2.2 对超氧阴离子自由基的清除作用

超氧阴离子(O2-)是化学离子中的一种，在生物体内有一定数量的存在，具有强氧化性.当其在体内没有化学反应的发生时无害，但与羟基(-OH)结合后生成的产物会导致细胞DNA的损坏，从而破坏人类机体功能，导致机体发生氧中毒.利用邻苯三酚在碱性条件下会发生自氧化的反应，然后在形成一种中间产物.释放出了超氧阴离子自由基，生成有颜色的中间产物.反应开始后会有颜色的变化，从黄绿色变为黄色.倘若加入的物质具有抑制邻苯三酚的自氧化速度，那么超氧阴离子自由基的产生量就会明显地减少.因此，可以用邻苯三酚的自氧化速度受到抑制的程度大小，来表征超氧阴离子自由基的清除率.

图2 枇杷叶总黄酮对超氧阴离子自由基的清除率影响

从图2可以看到，随着质量浓度的逐步增加，对自由基的清除率也逐渐增加.维生素C的清除率也呈上升的趋势.但维生素C的增长幅度较小，其原因可能是邻苯三酚自氧化的过程中维生素C对其自氧化速度的抑制作用不强，但是枇杷叶总黄酮的清除效果非常明显，这两种物质对超氧阴离子自由基的清除能力，枇杷叶总黄酮是强于维生素C的.

2.3 还原能力的测定

还原能力与其抗氧化能力息息有关.原理是枇杷叶总黄酮将三价铁离子还原成二价铁离子，由于二价铁离子不稳定，会与三价铁离子发生反应，生成普鲁士蓝.检测普鲁士蓝的吸光度值来表示还原能力的大小.在700 nm波长的分光光度计下测定其吸光度值.吸光度值越高，则说明其还原能力越强.因此试验中以二价铁离子的数量来表示枇杷叶总黄酮的还原能力.

图3所示的是枇杷叶总黄酮还原能力的测定结果.当浓度升高时，枇杷叶总黄酮还原能力的效果较强，枇杷叶总黄酮的还原能力与质量浓度的线性关系比维生素C的好.

图3 枇杷叶总黄酮对还原能力的影响

2.4 清除DPPH自由基能力

DPPH是一种以氮为中心的大分子稳定自由基，具有很强的刺激性，吸入、口服或皮肤接触都是有害的,其原理是：A-H+DPPH·→DPPH-H +A·,利用DPPH·单电子在517 nm处的强吸收(深紫色).当含有清除自由基的物质时，自由基清除剂中给出一个氢会与DPPH结合发生反应，DPPH·单电子被配对，使其颜色发生变化，由紫色变为淡黄.吸光度值也随着减少，反应结束后达到稳定.由此可以利用颜色的变化，测出吸光度值来反映枇杷叶总黄酮对DPPH自由基的清除能力.

图4 枇杷叶总黄酮对DPPH自由基的清除率影响

从图4可以看到，随着质量浓度的逐步增加，对DPPH自由基的清除率也逐渐增加.枇杷叶总黄酮与维生素C对DPPH的清除能力与质量浓度成线性关系.总体上，维生素C的线性关系比枇杷叶总黄酮的线性关系要好.

3 讨论

根据结果图的分析来看，维生素C与枇杷叶总黄酮随着质量溶度的增加清除力增强.在羟自由基试验中，计算得出的结果说明维生素C对羟自由基的清除能力要强于枇杷叶总黄酮.在超氧阴离子自由基试验中，计算得出的结果说明枇杷叶总黄酮的超氧阴离子自由基清除能力要强于维生素C.在还原力测定试验中，结果图中得出枇杷叶总黄酮的还原能力要强于维生素C.在DPPH自由基试验中，计算得出的结果说明维生素C对DPPH自由基的清除能力要强于枇杷叶总黄酮.与维生素C的结果比较来看，枇杷叶总黄酮有一定的抗氧化能力，并且随着质量浓度的增加，清除能力也加强.本实验的结果与黄琼[10]丁建英[11]等的结果一致，都是与质量浓度成正比例关系.综上所述，枇杷叶总黄酮化合物具有抗氧化能力，可以开发其成为自由基清除剂和抗氧化剂.

枇杷叶总黄酮是采用乙醇回流3次，除杂之后的得率为2.13%.黄酮类物质在不同的植物体内含量不同，其提取的方式也不同，使得黄酮类物质的商业化生产及应用具有一定的困难[12-13].从结果来看，黄酮化合物对自由基起作用.与阳性对照组维生素C的对比图可以得出，枇杷叶总黄酮对自由基有较强的清除能力，可以将其作为抗衰老的物质使用，并且开发其作为一种补品，同时有利于预防和治疗衰老.

4 结论

用乙醇浸膏法的提取工艺，测得枇杷叶总黄酮的得率为2.13%.体外抗氧化试验结果表明，在一定的浓度范围内，枇杷叶总黄酮的抗氧化能力随质量浓度的增加而增强，能够很好地清除自由基,并且清除自由基能力与浓度存在量效关系.实验中所用的枇杷叶总黄酮未进一步分离纯化，经过纯化后，抗氧化活性会进一步提高.由此可见，枇杷叶总黄酮是一种很好的天然抗氧化剂，具有广泛的应用前景和开发价值.