琼脂微球偶联氨基化合物及其效果分析

冶昡青，杜江龙，刘振斌，乔自林，冯玉萍

(西北民族大学 生物医学研究中心，甘肃 兰州 730030)

微载体是一类无毒性、非刚性、密度均一的高分子微球.微载体培养技术首先由WEZEL[1-3]等于1967年提出，经过近半个世纪的发展，目前已成为生物医药制品领域主导的生产方法.在国内，微载体培养技术相对滞后，主要原因是培养基、生物反应器和微载体三方面都依赖于进口.琼脂是由琼脂糖和硫琼胶组成的无特异性的吸附蛋白，是理化性质稳定、生物相容性好的高分子聚合物[4-8]，将琼脂固化交联制备后精确筛选大小得到琼脂微球.在微球表面引入一些亲和性配基后，将此琼脂微球用作亲和层析介质，一方面保证了纯植物源性生物材料作为原料，另一方面又解决了琼脂糖原料昂贵的问题[9]. 口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot And Mouthdisease Virus,FMDV)感染而引起的偶蹄动物共患的急性发热性传染疾病，它有畜牧业“头号杀手”的称号，故而口蹄疫的防治始终受到世界各国的重视[10-12].目前，口蹄疫灭活疫苗的接种是预防和控制口蹄疫发生并流行的最主要方法.通过采用纯化技术，分离与纯化疫苗的免疫活性成分，去除其他生物源性杂质成分，能够较好地降低或避免疫苗接种后发生副反应，从而大大增加了病毒疫苗的安全性.马全英[13]等人利用离子交换层析法，分离纯化了口蹄疫病毒抗原,结果表明.在一定条件下，利用阴离子交换树脂可以制备出高纯度的FMDV抗原[8]. 亲和层析，是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，从而使目标产物得到分离纯化的液相层析法[14-16].亲和层析介质具有较大的载量，较强的分离性和较高的选择性，可使待分离的生物大分子，从复杂的混合物中分离出来,达到千倍以上的纯化,又能保持较高的活性[17-19].亲和层析技术是分离纯化和分析病毒、抗原、抗体、细胞、细胞器、激素、抑制剂、糖蛋白、结合蛋白、酶、核酸等生物大分子的有力工具[20,21]. 本文以自制阴离子交换剂琼脂微球为分离纯化用介质，设计正交试验.在不同条件下，给琼脂微球表面偶联氨基，用凯氏定氮法测定含氮量，筛选出偶联效果最佳的分离纯化介质，并利用该介质分离纯化口蹄疫灭活病毒抗原，检测其分离纯化效果.其目的是在初步探究琼脂微球最优偶联氨基化合物的反应条件，以及该自制亲和层析介质在分离纯化口蹄疫灭活病毒抗原方面的应用效果.综上所述，本实验为进一步研究开发琼脂微球阴离子交换介质在口蹄疫病毒抗原的分离纯化中提供了一定的参考依据.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

琼脂粉(上海山浦化工，分析纯)，氢氧化钠(烟台市双双化工，分析纯)，环氧氯丙烷(烟台市双双化工，分析纯)，99%B-苯乙胺(上海阿拉丁有限公司，分析纯)，盐酸(山东恒通化工股份有限公司，分析纯)，硼酸(江西省南华贸易有限公司，分析纯)，溴甲酚绿(天津市凯信化学有限公司，分析纯)，甲基红(天津市凯信化学有限公司，分析纯)，TRIS(上海经科化学科技有限公司，分析纯)，试验用水为去离子水.

电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)，HJ-6A多头加热磁力搅拌器(常州国华电器有限公司)，全自动凯氏定氮仪(丹麦福斯公司)，循环水式多用真空泵SHZ-95B型(上海耀特仪器设备有限公司)，AKTA PURIFIER蛋白纯化仪(GE HEALTHCARE公司)，酸度计SG-2型(梅特勒-托利多仪器有限公司).

1.2 方法

1.2.1 琼脂微球的制备

准确配制4%的琼脂溶液[18]作为水相.按照100∶1的体积比配制环己烷和司盘-80的混合溶液作为油相，在搅拌的条件下,将水相缓慢地倒入油相,保温乳化一段时间后降至室温,停止搅拌,洗涤[19].

1.2.2 琼脂微球的交联固化

用75 μm和100 μm的铜筛筛选出大小75 μm～100 μm的琼脂微球，称取该微球15 g，去离子水洗净静置滤干，微球中加入3 mol/L的NaOH溶液30 mL，再加入15 mL的环氧氯丙烷活化剂，保持一定速度，40 ℃恒温搅拌3.5 h.

1.2.3 交联琼脂微球表面氨基的偶联

取75 μm～100 μm交联后抽干的琼脂微球15 g，加入2 mol/L的NaOH溶液，再加入β-苯乙胺，搅拌状态下加热至50 ℃，反应一段时间后依次用自来水、去离子水洗净，于25%的乙醇溶液中，4 ℃保存琼脂微球.为了确定偶联氨基的最优工艺，试验设计了L9(34)正交试验(见表1).试验考察了苯乙胺的量，NaOH的量三个因素对偶联效果的影响，采用凯氏定氮测得氮含量评价偶联效果.

1.2.4 偶联效果的检测

称取纯水洗净抽干的待测偶联氨基的微载体各0.2 g，分别加入浓硫酸10 mL，催化剂(由0.1 g CuSO4·5H2O和1.5 g K2SO4制做而成)一片.将氢氧化钠3.5 g，0.1%的溴甲酚绿40 μL，溶于50 mL去离子水，加入抽酸仪中(抽酸仪中的溶液呈现蓝色后不再添加)420 ℃消化样品1 h.待冷却后凯氏定氮仪上分别蒸馏样品，再用0.1 N-HCl滴定三角瓶内样液至其刚好变为浅紫色，记录消耗盐酸用量，实验组记为Tn，空白组中消耗盐酸最少用量记为Dmin，计算总蛋白含量最高的一组样品.

待测样品含氮量：F(%)=(Tn-Dmin)×14.007×CHCl×100%/mn

待测样品总蛋白含量：FN(%)=F(%)×6.25.

注：mn单位为mg

1.2.5 琼脂微球对口蹄疫病毒分离纯化效果检测

分别取洗净抽干的药厂口蹄疫病毒抗原分离纯化介质和偶联氨基效果最佳的琼脂微球各15 g，溶于10 mL去离子水，安装于层析柱，平衡层析柱后启动AKTA PURIFIER蛋白纯化仪.取3 mL的口蹄疫灭活病毒抗原，上样1 mL，10 mmol/mL、pH为8.0、含有0.15 M的NaCl的Tris-HCl洗脱液洗脱纯化后的口蹄疫灭活病毒抗原，收集3 mL/管洗脱液.对口蹄疫灭活病毒抗原进行分离纯化，最终得到二者的层析柱效图.对柱效图所显示的口蹄疫灭活病毒抗原洗脱峰的出峰时间、出峰高度和出峰面积进行比较.

2 实验结果与讨论

2.1 氨基偶联结果

待测样品含氮量F(%)=(Tn-Dmin)×14.007×CHCl×100%/mn

将各组实验中的Tn、Dmin、mn值和CHCl代入式(3)得表2结果.

表2 正交试验结果

对试验结果中的R(极差)进行比较表明：正交试验中的三个主要因素对琼脂微球含氮量的影响主次顺序依次为A(苯乙胺的量)> C(偶联时间)>B(NaOH的量).三个主要因素对琼脂微球含氮量的影响均远大于实验中随机误差(空列)的影响.

均值分析表明：活化后的琼脂微球在20 mL 2 M的 NaOH水溶液，6 mL的苯乙胺，50 ℃偶联反应2.5 h的条件下，偶联效果最佳，最优偶联条件下琼脂微球介质的含氮量为0.4486%.

2.2 分离纯化口蹄疫病毒抗原的检测结果及讨论

图1和图2中的层析柱效图，均装于高4 cm，直径2 cm的层析柱中，在AKTA purifier层析仪下分离纯化样液所得.样液均为A药厂提供的口蹄疫灭活病毒抗原，层析过程中样液流速均为1 mL/min.

图1A所用介质，是A药厂的介质X，具体制备工艺及成分不明，用于分离纯化口蹄疫灭活病毒抗原.该图前两个洗脱峰为杂蛋白的洗脱峰，出峰时间为第2.14 min和第5.11 min.最后一个洗脱峰为口蹄疫灭活病毒抗原的洗脱峰，出峰时间为第36.92 min，出峰高度为5.720 Mau，出峰面积为18.5259 Mau mL.

A：A药厂口蹄疫灭活病毒抗原层析介质柱效图 B：本实验室口蹄疫灭活病毒抗原层析介质柱效图

图2 自制口蹄疫灭活病毒抗原层析介质柱效图

图1B所用介质，是本实验室先前制备的用于分离纯化口蹄疫灭活病毒抗原的层析介质Z，所用材料与本次实验相同，但实验条件不同.用介质Z亲和层析口蹄疫灭活病毒抗原，得到第一个洗脱峰是杂蛋白的洗脱峰，出峰时间为第4.6 min.第二个洗脱峰为口蹄疫灭活病毒抗原的洗脱峰，出峰时间为15.89 min，出峰高度为8.399 Mau，出峰面积为15.2659 Mau mL.

图2所用介质，是本次实验偶联苯乙胺效果最佳的亲和层析介质.用该介质亲和层析口蹄疫灭活病毒抗原，得到第一个洗脱峰是杂蛋白的洗脱峰，出峰时间为第5.15 min.第二个洗脱峰为口蹄疫灭活病毒抗原的洗脱峰，出峰时间为35.85 min，出峰高度为5.023 Mau，出峰面积为18.3672 Mau mL.

层析柱效图和数据显示,相对于本实验室之前制备的分离纯化口蹄疫灭活病毒抗原的介质Z，本次实验制备的介质具有更长高度、更大面积的洗脱峰，在分离纯化口蹄疫灭活病毒抗原方面具有更优的层析效果.本次实验制备的亲和介质在分离纯化口蹄疫灭活病毒抗原时，抗原的出峰时间、出峰高度及出峰面积与A药厂的层析介质X的数据基本一致.结果表明，自制的该亲和层析介质对于口蹄疫灭活病毒抗原有较优的分离纯化效果.

3 结论

亲和层析柱效结果表明，本研究最优偶联条件下，偶联了苯乙胺的琼脂微球介质对口蹄疫灭活病毒抗原具有较好的分离纯化作用,在口蹄疫灭活病毒抗原分离纯化方面提供了一定的参考依据.本研究中，琼脂微球表面偶联苯乙胺的最优条件是：琼脂微球15 g，浓度为3 M的NaOH水溶液30 mL，环氧氯丙烷15 mL，40 ℃活化反应3.5 h；浓度2 M的NaOH水溶液20 mL，6 mL苯乙胺，50 ℃偶联反应2.5 h，测得该微球的含氮量是0.4486%.