流式细胞术优化MDCK细胞基因转染效率的研究

王家敏，王美皓，马玉梅，靳冬武，赵彩红，李自良，乔自林，马忠仁

(1.西北民族大学 生物医学研究中心 甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030；2. 西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；3.兰州百灵生物技术有限公司，甘肃 兰州 730010)

转染是指真核细胞接收外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程.该技术广泛应用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物等研究[1,2].目前通常使用的方法有电击转染法、脂质体转染法、病毒介导转染和磷酸钙沉淀法.脂质体转染法因其操作简便、结果可靠、可携带大片段DNA、可重复性强和安全性好等而被广泛采用，但不足之处是转染效率较低[3].因此，如何做到无害且高效地将目的基因导入靶细胞是脂质体介导的基因转染技术的关键.MDCK细胞是目前公认的替代鸡胚生产流感疫苗的传代细胞系之一，但该细胞系的致瘤性问题一直备受关注.对于致瘤机理研究必将是今后的研究重点，MDCK细胞基因转染将是必不可少的实验技术[4,5].本研究探究了脂质体介导的MDCK细胞基因转染效率，并优化获得了较佳的转染方案，以期为MDCK细胞开展基因操作提供一定的理论和数据基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

贴壁培养型MDCK细胞从ATCC引进，引进后由甘肃省动物细胞技术创新中心按《中国药典》2010版的要求建立主细胞库(MDCK-M-60，P60)和工作细胞库(MDCK-W-63，P63).

1.1.2 培养基及血清

DEME(high-glucous，兰州百灵生物)；Opti-MEM®Medium(Gibco)；胎牛血清(批号：20150715，兰州民海生物).

1.1.3 基因转染试剂

p-EGFP-C1质粒(甘肃省动物细胞技术创新中心保存提供)；Lipofectamine®2000 Reagent(11668-030, Invitrogen).

1.1.4 主要试剂及仪器

0.25%胰蛋白酶(兰州百灵生物)、0.2%台盼蓝(Sigma)、PBS(兰州百灵生物)、T25方瓶(Corning)、24孔细胞培养板(Corning)、倒置荧光显微镜(Olympus,CKX-41)、CO2培养箱(ThermoFisher, 3111型)、细胞计数仪(Countstar, IC1000)、流式细胞仪(Beckman Coulter)等.

1.2 方法

1.2.1 MDCK细胞复苏与培养

根据慢冻快融的原则[6]，复苏MDCK-W-63工作库细胞1支，加至10 mL含10%(V/V)胎牛血清的DMEM 培养液的T25细胞培养瓶中，置CO2培养箱(37 ℃、5.0% CO2)培养.次日观察，更换新鲜培养液，继续培养.待细胞长成致密单层后，常规方法消化，按照2×104/cm2的密度接种MDCK细胞至24孔细胞培养板中，置CO2培养箱(37 ℃、5.0% CO2)培养，培养48 h，用于转染实验.

1.2.2 MDCK细胞转染效率优化

挑选MDCK细胞汇合度达到90%的细胞进行转染.转染前，按照表1的配比将质粒和脂质体分别用Opti-MEM®培养液稀释至125 μL，并充分混匀，室温孵育5 min.弃细胞旧培养液，PBS洗涤3次，将质粒与脂质体混合物分别逐滴加入，每个配比浓度设置4个复孔，置于CO2培养箱(37 ℃、5.0% CO2)中培养，6 h后换成DMEM完全培养液继续培养[3].

表1 MDCK细胞基因转染质粒与脂质体(μg∶μL)配比表

1.2.3 流式细胞术及细胞计数仪检测

取转染后36 h的MDCK细胞，于倒置荧光显微镜下观察MDCK细胞中增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)的表达情况，收集细胞制成单细胞悬液，800 rpm离心5 min，弃上清液，加入2 mL PBS重悬，流式细胞术检测转染效率.将细胞悬液与0.2%台盼蓝溶液以1∶1的比例混匀，细胞计数仪计数细胞活率[7].

1.2.4 统计学分析

样本用x±s表示，使用SPSS16.0进行单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性意义.

2 结果分析

2.1 MDCK细胞复苏、培养与观察

复苏的MDCK细胞贴壁后状态良好，形态呈扁平状，多呈不规则扁平的多角形，中央有扁圆形核.按照2×104/cm2的密度接种至24孔细胞培养板，培养48 h，显微镜下观察发现MDCK细胞状态较好，达到90%的汇合度，见图1.

图1 MDCK细胞生长状态

2.2 MDCK细胞转染效率分析

本研究按照质粒浓度设置三大组，分别为0.2 μg、0.5 μg、0.8 μg，又按照质粒(μg)和脂质体(μL)的比例设置五大组，分别为1∶1、1∶ 1.5、1∶ 2、1∶ 2.5、1∶ 3 ，并设置阴性对照组，共16组实验.详细实验结果见表2、表3.

表2 脂质体介导的质粒转染MDCK细胞活率和转染效率比较

表3 脂质体介导的质粒转染MDCK细胞流式细胞术分析图谱

结果发现，转染后MDCK细胞，15个实验组的细胞活率与阴性对照组差异不显著(P>0.05)，说明本实验设置的质粒于脂质体浓度转染MDCK细胞对细胞活力无明显影响.

另外，设置的三大组质粒浓度下，质粒(μg)∶脂质体(μL)五个比例浓度中，均发现MDCK细胞转染率∶质粒浓度0.5 μg高于0.8 μg高于0.2 μg，且差异显著(P<0.05)，因此MDCK细胞转染最佳质粒浓度为0.5 μg.在质粒浓度为0.5 μg实验大组，随着脂质体浓度的增加MDCK细胞转染率逐渐增加，当质粒(μg)∶脂质体(μL)浓度为0.5∶ 1.0、0.5∶1.25、0.5∶ 1.5时，转染率达到了较高水平，分别为(23.4±3.4)%、(24.5±4.5)%、(25.2±3.7)%.因此，从经济因素来考虑，脂质体介导的MDCK细胞基因转染质粒(μg)与脂质体(μL)的最佳配比浓度为0.5∶ 1.0.

3 讨论

脂质体介导的基因转染是研究目的基因生物学特性不可缺少的实验操作，而高效的基因转染效率是脂质体介导转染实验操作成功的关键[8].一般为了获得高效的表达效率，在转染不同目的基因和应用不同受体细胞时均需要进行优化转染条件的摸索.目的基因的转染和表达效率的检测方法有多种，常用的方法有实时荧光定量PCR和免疫荧光等，分别从mRNA和蛋白水平检测，还可以通过相应的功能实验检测[9].但上述方法均较为费时费力，如何获知优化的转染条件，以便获得较高的转染效率和较高的目的基因表达情况，进而为后续目的基因的生物学活性研究奠定基础成为转染的重点和难点[10].