预培汤对邻苯二甲酸二（2－乙基）己酯染毒大鼠胚胎发育及氧化应激的影响

浙江中医药大学附属广兴医院 杭州 310007

邻苯二甲酸二 （2－乙基） 己酯 （di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP）作为一种典型增塑剂被广泛应用于食品包装材料、容器、儿童玩具、医疗用品、化妆品及人造革等[1-3]。近年的研究表明，DEHP及其代谢产物具有明显的生殖和发育毒性，可在妊娠早期干扰着床过程、造成胚胎丢失，并在妊娠中晚期影响胎盘及胎儿发育[4-7]，但是目前尚没有公认有效的防治方法。第五批全国老中医药专家学术经验继承工作指导老师傅萍教授总结了四十余年的临床经验，根据预培其损的治则提出了经验方预培汤，该方由黄芪、党参、熟地、山药、茯苓、白术、当归、白芍、川芎、甘草组成，有培本益元、抗毒安胎的功效。临床上傅萍教授常以预培其损法治疗各种滑胎患者，疗效显著[8]。本研究以DEHP暴露妊娠大鼠模型为研究对象，观察预培汤干预对大鼠胚胎发育及胎盘组织学改变的影响，并基于胎盘组织总抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶 （glutathione peroxidase，GSHPx）、 过氧化氢酶 （catalase，CAT）、 活性氧（reactive oxygen species，ROS）、 丙 二 醛 （malondialdehyde，MDA）等指标，探讨预培汤可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SPF级70d龄健康未生育雌性SD大鼠36只，体质量230～260g；性成熟雄性SD大鼠36只，体质量300～350g，均购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2018-0006]，均饲养于浙江中医药大学动物实验中心[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2018-0012]，饲养温度20～25℃，相对湿度40%～60%，自由饮食和进水。

1.2 染毒物质及药物 DEHP（分析纯，浓度≥99.5%）购于美国Sigma公司（批号：20180105）；玉米油（试剂级）购于杭州昊鑫生物科技有限公司（批号：20180108）。预培汤处方：黄芪15g，党参15g，熟地12g，淮山药12g，白术 9g，茯苓 12g，当归 9g，白芍 9g，川芎 9g，甘草 5g。所有药物均由杭州市中医院中药房提供，制备成含生药4.4g·mL-1的溶液。 在开始正式实验前，选择1.1g·mL-1、2.2g·mL-1、4.4g·mL-1分别作为低、中、高剂量组进行了预实验，结果提示，低、中剂量组与模型组比较，各指标无统计学差异，故将4.4g·mL-1作为预培汤煎液的最终浓度进行正式实验。中药灌胃等效剂量换算参考文献[9]中的人与动物体表面积折算比率表。

1.3 主要试剂和仪器 T-AOC检测试剂盒、GSH-Px检测试剂盒、SOD检测试剂盒、CAT检测试剂盒、ROS检测试剂盒及MDA检测试剂盒均购于南京建成生物研 究 所 （批 号 ：20190220、20190126、20190124、20190413、20190421、20190108）；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染液购于北京Solarbio公司（批号：G1120）。RM2016切片机和EG1150包埋机购于德国莱卡公司；BX51T-PHD-J11显微镜为日本奥林巴斯公司产品；GL-400SD超声波细胞破碎仪购于南京先欧仪器制造有限公司；5810R型台式高速冷冻离心机购于德国Eppendorf公司；Filtermax F5多功能酶标仪购于奥地利Molecular Devices公司。

1.4 实验动物分组及处理 将36只雌性SD大鼠随机分为对照组、模型组、预培汤组，每组12只，与雄性SD大鼠同笼（雌雄比例1:1），次日8:00检查有无阴道栓，如发现阴道栓则提示妊娠，将当天记录为妊娠0d，以此推算妊娠日期。从妊娠0d开始，对照组每日上午予玉米油10mL·kg-1灌胃，下午予0.9%氯化钠溶液10mL·kg-1灌胃；模型组每日上午予 DEHP 500mg·kg-1灌胃，下午予0.9%氯化钠溶液10mL·kg-1灌胃；预培汤组每日上午予DEHP 500mg·kg-1灌胃，下午予预培汤煎液10mL·kg-1灌胃，各组均持续灌胃至妊娠18d。给药期间每日称量大鼠体质量，并根据体质量调整用药剂量，至妊娠第19天处死孕鼠，剖腹取出胎鼠，称量胎鼠质量，记录各组孕鼠妊娠胎数以及其中的活胎数、死胎数、明显外观畸形胎数；并记录各组胎盘外观、色泽、体质量。取约0.2g胎盘组织，以PBS冲洗干净，4%甲醛固定24h后石蜡包埋，连续切片行病理学检测；另取约0.2g胎盘组织，以液氮快速冷却后，-80℃超低温冰箱保存，用于氧化应激指标检测。

1.5 实验指标检测

1.5.1 胎盘组织病理学检测 每个样本取相同部位胎盘组织，4%甲醛固定24h后石蜡包埋、切片，采用HE染色，置于100倍光学显微镜下观察。

1.5.2 氧化应激指标检测 大鼠胎盘组织经冰冷的0.9%氯化钠溶液冲洗后，滤纸拭干，称重后剪碎，以玻璃匀浆器研磨，制成10%匀浆液，离心后取上清液，分别检测组织匀浆中 T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT、ROS和MDA的水平，具体操作严格按照试剂盒说明书进行，参照标准曲线计算标本相应指标的测定值。

1.6 统计学分析 采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，两组计量资料比较前，先进行正态性检验，满足正态分布采用独立样本t检验，不满足则采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较 按照雌雄比例1:1连续合笼8d后各组大鼠受孕情况如下：对照组11只、模型组10只、预培汤组11只。灌胃过程中，各组大鼠一般情况良好，毛发整齐，光亮润泽，反应灵敏，饮食进水未见明显异常，无动物死亡。

2.2 各组孕鼠孕期体质量增加量及妊娠结局 各组大鼠孕早期（0～10d）体质量增加量无统计学差异（P＞0.05）；模型组大鼠孕中后期（10～18d）体质量增加量明显低于对照组 （P＜0.05），预培汤组大鼠孕中后期（10～18d）体质量增加量高于模型组(P＜0.05）。 各组孕鼠妊娠胎数、活胎数、死胎数均未见统计学差异（P＞0.05）；各组均未发现明显外观畸形胎鼠，对照组、预培汤组总死胎数较模型组明显减少。见表1。

2.3 各组胎鼠及胎盘一般情况比较 除死胎形成的吸收胎盘之外，各组孕鼠胎盘无明显外观差异。见图1。模型组胎鼠体质量低于对照组（P＜0.05），预培汤组胎鼠体质量高于模型组（P＜0.05）；各组大鼠胎盘体质量无统计学差异（P＞0.05）。 见表 2。

2.4 各组大鼠胎盘组织病理结果比较 模型组大鼠胎盘结构较乱，其海绵滋养层明显疏松杂乱，出现较多空泡。预培汤组大鼠胎盘结构完整，层次明显清晰，由内 （子体面）到外 （母体面），迷路带（labyrinth zone）、海绵滋养层（sponge trophoblast）、巨细胞滋养层（giant cell trophoblast）均清晰可见，各层中细胞分布均优于模型组。见图2。

2.5 各组大鼠胎盘氧化应激指标比较 模型组TAOC、GSH-Px、SOD、CAT 水平显著低于对照组 （P＜0.01），ROS、MDA 水平显著升高（P＜0.01）；预培汤组T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT 水平高于模型组 （P＜0.05，P＜0.01），ROS、MDA 水平则明显降低（P＜0.05）。见表3。

表1 各组大鼠孕期体质量增加量及妊娠结局比较（±s）Tab.1 Comparison of the weight gain during pregnancy and pregnancy outcome in each group(±s)

表1 各组大鼠孕期体质量增加量及妊娠结局比较（±s）Tab.1 Comparison of the weight gain during pregnancy and pregnancy outcome in each group(±s)

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05Note:Compared with control group,*P＜0.05;compared with model group,△P＜0.05

组别 n 孕早期体质量增加量（g）孕中后期体质量增加量（g） 妊娠胎数（只） 活胎数（只） 死胎数（只） 总死胎数（只）对照组 11 19.8±2.17 56.09±2.16 12.45±0.45 11.7±0.41 0.72±0.27 6模型组 10 21.40±3.47 47.40±2.44* 12.20±0.33 10.90±0.50 1.30±0.37 13预培汤组 11 22.45±2.54 54.25±1.80△ 11.45±1.05 11.1±1.00 0.36±0.20 4

图1 活胎胎盘与死胎胎盘外观比较Fig.1 Comparison of the appearance of live placenta and stillbirth placenta

表2 各组胎鼠及胎盘体质量比较（±s）Tab.2 Comparison of fetal rat and placental weight in each group(±s)

表2 各组胎鼠及胎盘体质量比较（±s）Tab.2 Comparison of fetal rat and placental weight in each group(±s)

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05Note:Compared with control group,*P＜0.05;compared with model group,△P＜0.05

组别 n 胎鼠体质量（g） 胎盘体质量（g）对照组 11 1.91±0.038 0.40±0.021模型组 10 1.73±0.065* 0.41±0.022预培汤组 11 1.90±0.049△ 0.42±0.019

图2 各组大鼠胎盘组织病理结果比较（HE染色，100×）Fig.2 Comparison of histopathological results of placenta in each group(HE staining,100×)

表3 各组大鼠胎盘氧化应激指标比较（±s）Tab.3 Comparison of placental oxidative stress indicators in each group(±s)

表3 各组大鼠胎盘氧化应激指标比较（±s）Tab.3 Comparison of placental oxidative stress indicators in each group(±s)

注：与对照组比较， **P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01Note:Compared with control group,**P＜0.01;compared with model group, △P＜0.05, △△P＜0.01

组别 T-AOC（mmol·g-1） GSH-Px（U·mg-1） SOD（U·mg-1） CAT（U·mg-1） ROS（RLU·mg-1） MDA（nmol·mg-1）对照组 1.09±0.69 27.52±1.22 66.86±4.83 68.54±3.32 906.10±41.94 3.91±0.19模型组 0.66±0.05** 18.02±0.59** 41.64±3.34** 39.20±2.55** 2 505.45±256.39** 6.88±0.36**预培汤组 0.82±0.03△ 25.15±0.96△△ 50.51±2.60△ 55.73±2.42△△ 1 818.39±75.08△ 5.37±0.33△

3 讨论

随着社会的不断发展，环境污染已经成为一个全球性的问题。其中一部分可以影响机体内分泌功能，对机体健康造成损害的环境化合物被称为“环境内分泌 干 扰 物 （environmental endocrine disruptors，EEDs）”。DEHP作为其中的典型代表，对人体生殖功能和生长发育都有较大的危害，目前关于其雄性生殖毒性已有较多研究[10]。与男性比较，女性更多地使用化妆品、洗涤用品、香水等，更容易暴露于DEHP环境中；而且妊娠期母体及胚胎对有害因素更加敏感，因此DEHP对于孕妇和胎儿的影响更加明显。已有研究表明，DEHP长期暴露不仅会干扰女性内分泌功能，影响生长发育；还会导致女性妊娠率降低、流产率增加[11-13]。但目前尚无可靠的文献研究表明某药物或治疗方案可拮抗DEHP的胚胎发育毒性，故本研究未设置相关阳性对照组。

从中医病因学来看，DEHP等环境污染致病因素是一种“毒”，作为一种致病因子直接损伤胎元，或造成母体脏腑气血阴阳的失调，损及冲任，导致流产或胚胎发育受损。本研究谨遵中医“治未病”的思想，以傅萍教授的经验方预培汤为干预因素，探讨预培汤防治DEHP生殖毒性的作用以及可能机制。黄芪，味甘，性温，功效补气固表、扶正解毒；党参，味甘，性平，能补中益气、扶正祛邪，二者俱为扶正祛毒要药，现代药理学研究发现二者不仅能提高机体免疫力，还具有显著的抗氧化作用，能拮抗多种不良因素对机体的氧化损伤[14-15]。本方以黄芪、党参益气抗毒为君药；熟地、山药益养先天，白术、茯苓顾护后天，当归、白芍养血和血，三组药对协同参、芪“预培其本”，共为臣药；川芎行气活血、补而不滞，为佐药；甘草解毒且补益中焦，能调和诸药，为使药。全方具有培本固元、抗毒解毒之功，可使机体达到“气血充盈，百病不生”的良好状态，抵御DEHP的生殖毒性，起到抗毒保胎之效。本研究结果提示，模型组大鼠孕期体质量增加量较低，胎鼠体质量明显降低，总死胎数有所增加，证实了DEHP暴露对大鼠胚胎发育的损伤作用；而预培汤干预后，大鼠孕期体质量增加量、胎鼠体质量均明显高于模型组，总死胎数也相应减少，提示预培汤对DEHP的生殖毒性具有一定的拮抗作用。

胎盘是支持胚胎发育的关键器官，也是DEHP生殖毒性的重要靶器官。近年对DEHP体内代谢的研究发现，人类孕妇胎盘组织及新生儿脐血中均已检测到DEHP的代谢产物[16-17]。本研究结果提示，模型组大鼠胎盘海绵滋养层明显疏松杂乱，出现较多空泡；而预培汤组胎盘组织结构层次分明，各层中细胞分布较为均匀紧密，均优于模型组，提示预培汤可以保护胎盘组织，拮抗DEHP的胚胎毒性，改善妊娠结局。

氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内氧化系统和抗氧化系统发生失衡，产生过量氧自由基，损伤正常组织的反应。本研究结果显示，DEHP会显著消耗机体T-AOC，降低GSH-Px、SOD、CAT活性，导致组织ROS水平显著升高，产生过量脂质氧化终产物MDA，从而损伤胎盘组织。预培汤组各氧化应激指标均明显优于模型组，提示预培汤可能的作用机制是拮抗氧化损伤，从而保护胚胎，改善妊娠结局。

综上所述，中药预培汤可减少DEHP对大鼠胎盘组织的损伤，改善染毒大鼠妊娠结局，其机制可能与纠正DEHP引起的胎盘组织内氧化应激失衡有关。本研究为中医药防治DEHP的生殖毒性提供了一定的实验依据，但本研究设计较为简单，未深入研究相关机制，对子代的观察也尚停留在早期阶段。今后的研究需要更长的观察来评估药物的影响，并进一步发掘具体的作用机制。