浙江香茶菜属植物抗肿瘤活性成分的比较研究及药效物质的快速发现

滕飞 杨波 林能明

1.浙江中医药大学药学院 杭州 310053 2.浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院浙江省临床肿瘤药理与毒理学研究重点实验室 3.浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院转化医学研究中心

唇形科香茶菜属[Lamiaceae Isodon(Schrader ex Bentham)Spac]植物是我国民间的常用草药，供药用的有30多种，富含萜类、黄酮、挥发油等多种成分。孙汉董院士等从香茶菜属植物中分离出80多种化学物质[1]，其中二萜类是香茶菜属植物中最典型的化合物类型[1-3]。浙江香茶菜属植物分布广泛，种类丰富，且不同生长环境和不同种类的香茶菜属植物地下部位二萜类含量明显不同，其药理作用也大不相同[4-6]。据《浙江省中药炮制规范（2015版）》[7]收载，中药香茶菜（Rhizoma Isodone）又名铁菱角、菱角三七，其来源是植物香茶菜或大萼香茶菜及同属数种植物的干燥根茎或地上部分。

迈克尔受体分子（Michael acceptor molecular）是含有烯键或炔键与吸电子基形成的亲电共轭体系的一类化合物，其与亲核负电体系进行的共轭加成反应称为迈克尔加成反应 （Michael addition reaction）[8-9]。已有研究报道，香茶菜属植物中存在大量对映贝壳杉烷型二萜类迈克尔受体分子，如冬凌草甲素、冬凌草乙素等[10-11]，该类化合物具有广谱抗肿瘤活性，且其活性机制与D环中的exo-亚甲基环戊酮结构有关，该结构可与氨基酸中的氨基、羟基、巯基等亲核基团发生反应，从而显示出较好的抗肿瘤活性[12-13]；故其也可与细胞中的还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）发生反应，降低细胞GSH水平，引起细胞受损及死亡[14]。

为研究浙江省香茶菜属不同植物的抗肿瘤活性和其中可能含有的有效成分，笔者选取产自浙江的7种香茶菜属植物，对其不同生长部位的有效成分含量差异进行了研究，并对对映贝壳杉烷型二萜类迈克尔受体分子抗肿瘤有效成分进行快速发现，以期初步阐明其抗肿瘤药效物质，并为研究迈克尔受体分子活性成分的发现提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 试药 香茶菜[Isodon amethystoides(Bentham)H.Hara]、显脉香茶菜 [Iondon nervosus(Hemsley)Kudô]、碎米桠[Isodon rubescens(Hemsley)H.Hara]采自浙江杭州市临安区；长管香茶菜 [Isodon longitubus(Miquel)Kudô]、大萼香茶菜[Isodon macrocalyx(Miquel)Kudô]采自浙江丽水龙泉市住龙镇；线纹香茶菜[Isodon lophanthoides(Buch.Ham ex D.Don)Hara]、岐伞香茶菜 [Isodon macrophyllus (Migo)H.Hara]采自浙江衢州市开化县，标本均保存于浙江中医药大学标本馆。

1.2 主要仪器 超高效液相色谱仪购于美国Waters公司，色谱柱为Waters ACQuity UPLC C18柱（2.1mm×100mm，1.7μm）； 超低温冰箱为美国 Forma公司产品；MK-3酶标仪购于美国Thermo Labsystems公司；D2012 Plus台式高速微量小型离心机购于上海安亭科学仪器公司。

1.3 主要试剂 GF254薄层层析硅胶板购于青岛海洋化工公司（批号：T11254）；甲醇、乙腈、香草醛购于上 海 阿 拉 丁 公 司 （批 号 ：M116126、A119010、B135387）；DMEM培养基、胰蛋白酶均购于美国Gibco 公司（批号：12100046、25200-056）；无支原体胎牛血清购于美国 Hyclone公司 （批号：SH30084.03）；MTT试剂购于美国 Amresco公司 （批号：97062-376）；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）为美国Sigma 公司产品（批号：D2650）。

1.4 细胞株 人源乳腺癌细胞MCF-7购于上海酶研生物科技有限公司，由浙江中医药大学药理研究所提供，采用含10%无支原体胎牛血清的DMEM完全培养基，在37℃，5%CO2条件下培养。

1.5 方法

1.5.1 样品制备 取显脉香茶菜地上部分约200g，粉碎后以95%乙醇1 600mL（约8倍量）回流提取3次，45min/次，合并3次提取液置于旋转蒸发仪上，减压蒸发回收乙醇至全干，加水混悬至约100mL，加等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液并置于旋转蒸发仪上，减压蒸发回收乙酸乙酯至全干，即得到显脉香茶菜地上部分乙酸乙酯提取物 （以下简称INE1）。

同样方法制备显脉香茶菜地下部分提取物（INE2）；长管香茶菜地上、地下部分提取物（ILO1、ILO2）；大萼香茶菜地上、地下部分提取物（IMA1、IMA2）；香茶菜地上、地下部分提取物（IAM1、IAM2）；线纹香茶菜地上部分提取物(ILS1)；碎米桠地上、地下部分提取物（IRU1、IRU2）；岐伞香茶菜地上、地下部分提取物（IMS1、IMS2）。

1.5.2 薄层色谱分析检识探究不同样品提取物的成分差异 为探究不同样品之间成分的差异性，对上述13种香茶菜属植物提取物进行薄层色谱分析（thin layer chromatography，TLC）检识。先将 13种样品点在同一块GF254硅胶薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯3:2混合溶液为展开剂，展距约为9cm。待展开剂晾干后，于254nm紫外灯下检识，1%硫酸-香草醛溶液显色，110℃加热至显色清晰。

1.5.3 MTT法测定不同样品提取物对肿瘤细胞的抑制作用 取生长状态良好且处于对数生长期的人源乳腺癌细胞MCF-7，制成细胞密度为1×105个/mL的细胞悬液，接种于96孔板。每孔加入细胞悬液100μL，再加入以DMSO溶解的不同样品提取物溶液10μL，以培养液补足体积为200μL，每个样品设置6个复孔；同时设置阴性对照组，细胞悬液体积同上，加入适量的磷酸盐缓冲液 （phosphate buffer saline，PBS）补足体积；空白对照组为不含细胞的培养基和DMSO[15]。培养48h后，以MTT法检测570nm波长处的光密度（optical density，OD）值，计算细胞增殖抑制率（%）和半数抑制浓度（50%inhibiting concentration，IC50）。 计算公式：细胞增殖抑制率（%）=[1-（OD不同样品组-OD空白对照组）/（OD阴性对照组-OD空白对照组）]×100%。依据细胞增殖抑制率计算IC50。

1.5.4 超高效液相色谱分析 依据MTT活性检测结果，大萼香茶菜地上部分对MCF-7细胞活性抑制效果最好，其余样品无明显抑制效果，因此选用大萼香茶菜地上部分进行后续实验，采用超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）对大萼香茶菜地上部分进行了分析。取IMA1 5mg加甲醇1mL配成浓度为5mg·mL-1的甲醇溶液，10 000r/min离心 15min，取上清液进行分析。进样量：1μL；柱温：30℃；样品温度：25℃；检测波长：220nm；流速：0.25mL·min-1；流动相：水-乙腈；梯度：0～1min 25%乙腈；1～21min 25%～85%乙腈；21～23min 85%乙腈；23～24min 85%～25%乙腈；24～27min 25%乙腈。

1.5.5 GSH探针分析 将IMA1样品配制成20mg·mL-1甲醇溶液，取40μL加入三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸[Tris(hydroxymethyl)aminomethane-hydrochloride，Tris-HCl]缓冲液-GSH 360μL作为实验组，以pH=8.00的Tris-HCl缓冲液作为阴性对照，37℃反应2h，10 000r/min离心15min，取上清液进行UPLC分析，色谱条件同1.5.4。

1.6 统计学分析 采用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各样品TLC检识结果 各样品TLC检识结果见图 1。 图中 1～13 分别为样品 INE1、INE2、ILO1、ILO2、IMA1、IMA2、IAM1、IAM2、ILS1、IRU1、IRU2、IMS1、IMS2。地上部分在254nm紫外灯下进行检识；地下部分斑点以1%硫酸-香草醛溶液为显色剂，日光下较为清晰。 地上部分样品 INE1（A1）、ILO1（A3）、ILS1（A9）、IMS1（A12）均有一个绿色斑点和一个黄色斑点，IMA1（A5）较其他地上部分样品多一个淡黄色斑点，而 IAM1（A7）和 IRU1（A10）的下部出现一个额外的浅褐色斑点。地下部分斑点以1%硫酸-香草醛溶液为显色剂，日光下较为清晰。其中样品INE2（B2）无可见斑点，ILO2（B4）、IAM2（B8）、IRU2（B11）、IMS2（B13）中部有一紫色斑点，IAM2（B8）上部还有一额外斑点，而IMA2（B6）只有上部有一棕色斑点。

图1 各样品TLC检识结果Fig.1 TLC inspection results for each sample

2.2 各样品对MCF-7细胞抑制作用比较 MTT法检测各样品对MCF-7细胞的抑制作用，以IC50＜30μg·mL-1为有效样品，舍弃 IC50＞30μg·mL-1的样品分析结果，认为 INE1、ILO1、IMA1、IRU1、IMS1 能够抑制 MCF-7 细胞生长，其中 IMA1（IC50=8.29μg·mL-1）抑制作用最强（P＜0.05）。 见表 1。

2.3 UPLC分析 由MTT检测结果得出，13种香茶菜属样品中IMA1具有较高活性，且大萼香茶菜为《浙江省中药炮制规范（2015版）》[7]规定的中药香茶菜药材来源植物之一，故以UPLC对IMA1进行了梯度分析，为GSH探针分析实验摸索条件。结果表明，IMA1共有13种主要化学成分（峰1～峰13），其中峰1、峰 2、峰 3、峰 6、峰 7、峰 12、峰 13 含量较高。见图 2。

表1 各样品对MCF-7细胞增殖抑制作用比较（±s，n=3）Fig.1 Comparison of the proliferation inhibitory ability of Isodon species on MCF-7 cells(±s,n=3)

表1 各样品对MCF-7细胞增殖抑制作用比较（±s，n=3）Fig.1 Comparison of the proliferation inhibitory ability of Isodon species on MCF-7 cells(±s,n=3)

注：与 IMA1 比较，*P＜0.05Note:Compared with IMA1,*P＜0.05

序号样品IC50（μg·mL-1）1 INE1 13.1*2 ILO1 24.8*3 IMA1 8.29 4 IRU1 14.7*5 IMS1 17.7*

图2 220nm下的IMA1 UPLC分析图谱Fig.2 UPLC analysis spectrum of IMA1 at 220nm

2.4 GSH探针分析 实验组将IMA1与GSH探针结合，通过UPLC分析得到图3A；阴性对照将IMA1与Tris-HCl结合，通过UPLC分析得到图3B。进一步与阴性对照峰面积的差异进行比较，判断其中是否存在迈克尔受体分子类物质，其中峰1、峰2和峰3显著增加，峰4、峰5略微减小，峰6、峰7完全消失，峰8、峰9有所减小，峰11、峰12未完全消失，由此判断这些化合物与GSH发生了不同程度的迈克尔加成反应，峰1、峰2和峰3为迈克尔加成产物，峰4、峰5、峰 6、峰 7、峰 8、峰 9、峰 11、峰 12 为迈克尔受体分子。见图3C。

3 讨论

本研究选用了浙江省主产的7种香茶菜属植物样本的地上部分和地下部分，因线纹香茶菜野外资源稀少，能够采集到的数量有限，且其植株柔弱，地下部分为极细小的须根，无法制备足够的样品，因此共制备了13个样品。经化学成分比对分析，确定了不同种香茶菜属植物化学成分的差异，并通过MTT法检测其对人源乳腺癌细胞MCF-7的抑制活性，结果提示这些植物的地上部分均有一定抗肿瘤活性，其中大萼香茶菜地上部分抗肿瘤活性最强。TLC结果表明，不同香茶菜属植物乙酸乙酯提取部位化学成分大部分相同，但大萼香茶菜的地上与地下部分与其他香茶菜属植物比较却有明显差异，笔者认为这正是大萼香茶菜提取物抗肿瘤效果优于同属其他样品的物质基础。进一步以GSH为探针，将IMA1与GSH共同孵育，通过比较化学成分的变化，特异性识别大萼香茶菜中的迈克尔受体分子类物质。容易发生加成反应的迈克尔受体分子具有较强的亲电性，容易与受体氨基酸发生作用，从而体现出较好的抗肿瘤活性。刘建群等[16]研究表明，迈克尔加成反应速率可能与抗肿瘤活性存在正相关性，因此图3中峰6和峰7化合物可能具有较好的抗肿瘤活性，值得关注。

图3 GSH探针孵育后UPLC分析Fig.3 UPLC analysis after GSH probe incubation

香茶菜属植物中大量含有的贝壳杉烷型二萜类成分是其抗肿瘤药效物质，该类成分是一类迈克尔受体分子，由GSH探针结合反应可知，IMA1中含有可与GSH上的游离巯基发生迈克尔加成反应的物质，能够使得细胞中GSH水平降低[17]。已有研究表明，香茶菜属植物富含对映贝壳杉烷型二萜，该二萜具有α-β不饱和羰基单元，为一类迈克尔受体分子[18]。GSH为亲核试剂，可以和该类成分发生加成反应，因此初步判断IMA1中的这些迈克尔受体分子为对映贝壳杉烷型二萜类，正是由于该类成分的存在使得IMA1表现出良好的抗肿瘤活性。同时本研究结果表明该方法可快速发现该属中迈克尔受体分子，为后续针对性分离和鉴定这些活性成分奠定了基础，并为香茶菜属植物资源的研究开发与合理利用提供了科学依据。