IL-27与乙酰半胱氨酸对博来霉素诱导的小鼠肺纤维细胞因子变化的影响

李昌波 孙杰 肖华毅 胡新春 邓超英

肺纤维化是一种难治性、高死亡率的肺间质性疾病，肺纤维化病因广泛，主要类型包括已知原因所致肺纤维化、特发性间质性疾病、肺结节病、其他类型的肺纤维化等。除已知原因类型肺纤维化外，其他类型的肺纤维化治疗前景堪忧，无特效药物[1-2]。肺纤维化发展为终末期，导致呼吸衰竭，肺移植是唯一的治疗方法。有相关文献及课题研究IL-27能有效抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化进程，减轻肺纤维化的程度[3-6]，本课题前期实验证实IL-27较N-乙酰半胱氨酸(NAC)能更有效抑制肺纤维化的程度，其机制不明；通过对各组小鼠肺组织中相关因子的检测，了解IL-27与NAC影响肺组织中相关因子的表达，推测其二者影响肺纤维化的机制。

资料与方法

一、材料

SPF级雄性C57/BL6小鼠(6～8周龄)80只，体重18～22g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于四川省内江市医科学校基础实验室，饲养环境为SPF级[7]。注射用博莱霉素粉针剂(bleomycin,BLM)(日本化药株式会社)，IL-27重组蛋白注射剂(美国Ebioscience公司)，N-乙酰半胱氨酸泡腾片(NAC)(海南赞邦制药有限公司)，组织研磨机(兰州轻工业机械有限公司)，ELSSA试剂盒(武汉华美生物科技有限公司)。

二、实验方法

1 实验分组 将80只C57/BL6小鼠随机分为正常组(A组)、BLM模型组(B组)、BLM+IL-27组(C组)、BLM+NAC组(D组)，每组各20只；给予10%水合氯醛麻醉小鼠后，A组小鼠采用经支气管一次性注入生理盐水0.05 mL；B、C、D组小鼠气管内注射博莱霉素溶液0.05 mL(5 mg/kg)复制肺纤维化模型[8]。C组造模后1d开始腹腔皮下注射小鼠IL-27重组蛋白溶液1ug/只/天，连续注射7天；D组造模前1周开始灌胃NAC溶液3mmol/kg.d，造模后继续每天灌胃NAC溶液直至处死[9-10]。

2 实验动物模型建立及取材 各组小鼠均在造模后第7天、14天、28天分别处死5只小鼠，采取放血法处死小鼠，分别获取双肺组织、脾脏，左肺组织用10%福尔马林溶液固定，24 h后进行石蜡包埋并切片行HE、Masson染色；右肺组织及脾脏置入液氮后转入-80℃冰箱保存备用。

3 右肺组织检测相关因子 取各组小鼠右肺部分组织用组织研磨机研磨成糊状，PBS稀释，获取组织上清液，滤过去除杂质。ELISA检测肺组织上清液中不同细胞因子浓度，根据标准品的浓度及标准品OD值分别建立标准曲线。检测各组小鼠肺组织上清液中的IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-10、IL-17的因子的浓度[11]。操作步骤按ELISA实验盒说明进行。

三、统计方法

结 果

一、各组小鼠肺组织中IFN-γ浓度结果(见图1、图2、表1)。

图1 IFN-γ浓度的标准曲线图

图2 IFN-γ细胞因子浓度柱状图(注：“#、##、##”表示同一时间点内不同组间差异有统计学意义；“*”表示同一组不同时间点差异具有统计学意义)

表1 各组小鼠肺组织中IFN-γ浓度结果统计表

注：表中多组比较方差分析数据差异有统计学意义(P<0.05)

由图1、图2、表1结果分析如下：不同时间点:A组各时间点IFN-γ浓度差异无统计学意义(P>0.05)；B、C、D组不同时间点间IFN-γ浓度差异具有统计学意义(P<0.05)，且趋势一致，即各组均是第7天最高，第14天其次，第28天最低。

同一时间点：B、D组在第14天和第28天两两比较IFN-γ浓度差异不具有统计学意义(P>0.05，见图2)；其余各组在不同时间点两两比较差异均具有统计学意义(P<0.05，见图2)，且表现为同一趋势，即:C组最高，B组最低。

二、各组不同时间点小鼠肺组织中TGF-β1浓度结果(见图3、4，表2)。

图3 TGF-β1浓度的标准曲线图

图4 TGF-β1细胞因子浓度柱状图(注：“#、##、##”表示同一时间点内不同组间差异有统计学意义；“*、**”表示同一组不同时间点差异具有统计学意义)

表2 各组不同时间点小鼠肺组织中TGF-β1浓度结果统计表

注：表中多组比较方差分析数据差异有统计学意义(P<0.05)

由图3、图4、表1结果分析如下：不同时间点:A组不同时间点内差异无统计学意义(P>0.05)；B、C、D各组在三个不同时间点数据差异具有统计学意义(P<0.05，见图4)，且均表现为同一趋势，即第28天TGF-β1浓度最高，第14天其次，第7天最低(见表2)。

同一时间点:7天、14点、28天不同时间点各组间差异具有统计学意义(P<0.05，见图4)，且表现为同一趋势，即各时间点TGF-β1的浓度均是B组最高，D组其次，C组再次，A组最低(见图4)。

三、各组不同时间点小鼠肺组织中IL-6浓度结果(见图5、6，表3)

图5 IL-6浓度的标准曲线图

图6 IL-6细胞因子浓度柱状图(注：“#、##、##”表示同一时间点内不同组间差异有统计学意义；“*、**”表示同一组不同时间点差异具有统计学意义)

表3 各组不同时间点小鼠肺组织IL-6浓度统计表

注：表中多组比较方差分析数据差异有统计学意义(P<0.05)

由图5、图6、表3结果分析如下:不同时间点:A组不同时间点内IL-6浓度差异无统计学意义(P>0.05)；B、C、D各组在三个不同时间点数据差异具有统计学意义(P<0.05，见图6)，且均表现为同一趋势，即第14天IL-6浓度最高，第28天其次，第7天最低(见表3)。

同一时间点:7天、14点、28天不同时间点各组间差异具有统计学意义(P<0.05，见图6)，且表现为同一趋势，即不同时间点均表现为IL-6的浓度均是B组最高，D组其次，C组再次，A组最低(见图6)。

四、各组不同时间点小鼠肺组织中IL-10浓度结果(见图7、8，表4)

图7 IL-10浓度标准曲线图

由图7、图8、表4结果分析如下: 不同时间点:A组不同时间点内IL-10浓度差异无统计学意义(P>0.05)；B、C、D各组在三个不同时间点数据差异具有统计学意义(P<0.05，见图8)，且均表现为同一趋势，即第7天IL-10浓度最高，第14天其次，第28天最低(见表4)。

同一时间点:7天、14点、28天不同时间点各组间差异具有统计学意义(P<0.05，见图8)，且表现为同一趋势，即不同时间点均表现为IL-10的浓度均是B组最高，D组其次，C组再次，A组最低(见图8)。

图8 IL-10细胞因子浓度柱状图(注：“#、##、##”表示同一时间点内不同组间差异有统计学意义；“*、**”表示同一组不同时间点差异具有统计学意义)

表4 各组不同时间点小鼠肺组织中IL-10浓度统计表

注：表中多组比较方差分析数据差异有统计学意义(P<0.05)

五、各组不同时间点小鼠肺组织中IL-17浓度结果(见图9、10，表5)

图9 IL-17浓度的标准曲线图

表5 各组不同时间点小鼠肺组织中IL-17浓度统计表

注：表中多组比较方差分析数据差异有统计学意义(P<0.05)

图10 IL-17细胞因子浓度柱状图(注：“#、##、##”表示同一时间点内不同组间差异有统计学意义；“*、**”表示同一组不同时间点差异具有统计学意义)。

由图9、图10、表5结果分析如下:不同时间点:A组不同时间点内IL-17浓度差异无统计学意义(P>0.05)；B、C、D各组在三个不同时间点数据差异具有统计学意义(P<0.05，图10)，且均表现为同一趋势，即第28天IL-17浓度最高，第14天其次，第7天最低(见表5)。

同一时间点:7天、14天、28天不同时间点各组间差异具有统计学意义(P<0.05，见图10)，且表现为同一趋势，即不同时间点均表现为IL-17的浓度均是B组最高，D组其次，C组再次，A组最低(见图10)。

讨 论

IL-27作为新近发现的白介素，其由活化的单核细胞、单核细胞来源的树突状细胞、淋巴细胞、NK细胞等产生。IL-27受体则在T细胞和NK细胞的表达水平最高[12]。本课题前期研究发现IL-27可以抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化过程。N-乙酰半胱氨酸(NAC)在氧化/抗氧化失衡和氧化应激在肺泡上皮细胞的损伤和纤维化中起重要作用。目前已有大量的研究发现NAC对肺纤维化有抑制作用，作用机制主要是抗氧化、稳定细胞结构、清除氧自由基、抑制血管生成因子β(TGF-β)等方面抑制肺间质中胶原蛋白的合成，从而抑制肺纤维化的形成[13]；NAC目前已被列为肺纤维化药物治疗中弱推荐药物[14]。本课题前期已证实IL-27与NAC均具有抑制博来霉素诱导的肺纤维化进程的作用，经肺组织HE、Masson染色证实IL-27干预组肺纤维化程度较NAC干预组轻，IL-27抑制肺纤维化作用更明显，作用机制不明。本研究通过检测各组小鼠肺组织中IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17等细胞因子的浓度，推测IL-27与NAC抑制肺纤维化的机制。

有相关研究发现再IPF患者血清中IFN-γ较健康患者明显减低；有相关小鼠肺纤维化实验中，发现肺纤维化模型小鼠肺组织中IFN-γ浓度较正常小鼠肺组织明显降低。本研究证实博来霉素可以抑制IFN-γ在肺组织中的浓度，诱导肺纤维化的形成,IL-27和NAC可以升高IFN-γ的浓度，减轻小鼠肺纤维化的程度，且IL-27组肺组织IFN-γ浓度高于NAC组，差异具有统计学意义(P<0.05)。相关研究发现TGF-β1、IL-6、IL-10、IL-17均能促进肺纤维化的形成。本研究发现TGF-β1、IL-17在第28天最高，第7天最低，表明TGF-β1、IL-17在药物诱导的肺纤维化晚期表达最高，主要是促进肺间质胶原蛋白的形成，在不同时间点浓度表达均是B组>D组>C组，推测各组间差异由IL-27、NAC所致，但IL-27组明显低于NAC组及肺纤维化模型组。IL-6的浓度在第14天最高，IL-10在第7天最高，但各组浓度表达不同，B组>D组>C组，IL-27组明显低于NAC组及肺纤维化模型组；IL-6、IL-10是致炎因子，均在肺纤维化的早期阶段最高，抑制致炎因子的表达可以有效抑制TGF-β1、IL-17，减少肺组织中胶原蛋白的生成，减轻肺纤维化的程度。

综上所述，IL-27、NAC均能抑制博来霉素诱导的小鼠肺组织中TGF-β1、IL-6、IL-10、IL-17的表达，但IL-27组明显低于NAC组，IL-27抑制肺组织炎症反应明显强于NAC；同时在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化进程中，IL-27较NAC能更有效诱导IFN-γ表达，即IL-27组明显高于NAC组。本研究发现，IL-27和NAC干预的博来霉素诱导的肺纤维化实验中，IFN-γ浓度明显高于肺纤维化模型组，TGF-β1、IL-6、IL-10、IL-17的浓度明显低于肺纤维化模型组，但IL-27较NAC效果更明显，其机制还需进一步实验研究。