miR-618 在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

谷士海 傅文生 邢化志

肺癌是全球常见恶性肿瘤之一，根据组织类型和临床病理特征可以将肺癌分为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)，其中NSCLC更为多见[1-2]。目前NSCLC的治疗主要包括手术、放疗、化疗和靶向治疗，虽然治疗技术取得了进步，但是NSCLC患者的预后仍然较差，5年总生存率约为15%左右，肺癌的治疗仍然是巨大的挑战[3-4]。分子靶向治疗可以精确的靶向肿瘤关键分子，改变其异常表达、阻断其异常功能从而抑制肿瘤的恶性生物学行为，达到治疗肿瘤的目的，已经证实多种分子靶向药物可以治疗NSCLC，并取得了较显著的疗效，但是靶向治疗同样存在耐药现象[5-6]，因此新的靶向分子仍需研究开发。

大量研究表明多种肿瘤中均存在微小RNAs(micro RNAs, miRNAs)异常表达，miRNAs参与调控肿瘤细胞增殖、侵袭转移、凋亡和耐药等恶性生物过程，并发挥关键作用[7-9]，越来越多的研究报道miRNAs可以作为药物靶点抑制恶性肿瘤的进展[10-11]。miR-618被报道为肿瘤抑制因子，在胃癌、前列腺癌、甲状腺癌等常见肿瘤发病过程中均发挥重要作用，是潜在的肿瘤治疗靶点[12-14]，然而目前少有关于miR-618与NSCLC相关的报道，miR-618是否参与了NSCLC的发生、发展还有待相关研究进行验证。本文通过研究miR-618在NSCLC中的表达及与患者临床病理参数和预后的关系，以期为miR-618作为NSCLC治疗候选靶点的临床应用提供实验基础数据。

资料与方法

一、临床资料

资料概况：本研究经医院伦理委员会审核通过。共收集2012年1月-2014年1月NSCLC组织和其配对的癌旁组织手术标本85例，其中患者年龄23～75岁，平均年龄(55.38±11.64)岁，男49例，女36例，腺癌44例，鳞癌41例，肿瘤直径：≤3 cm者43例，3 cm>者42例，TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期51例，Ⅲ～Ⅳ期34例，分化程度：中高分化55例，低分化30例，有淋巴结转移者40例，无淋巴结转移者45例。

纳入标准：(1)在我院行手术治疗，经手术病理切片证实为NSCLC；(2)具有完整的病例和随访资料；(3)所有患者均签署知情同意书。

排除标准：(1)术前接受化疗、放疗、免疫和靶向等抗肿瘤治疗者；(2)合并严重器质性疾病者；(3)合并其他肿瘤者；(4)合并有扩张性心肌病等影响miR-618表达的疾病者。

二、材料与试验方法

1 试剂与仪器 PrimeScriptTM RT reagent Kit逆转录、TRIzol裂解液、SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR试剂盒等均购自日本TaKaRa公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇等试剂均购自南京润升石化有限公司；miR-618和内参GAPDH引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成；Nondrop 2000 微量分光光度计购自美国Thermo公司；Mastercycler Ep Realplex实时荧光定量PCR仪购自德国Eppendorf公司。

2 qRT-PCR检测miR-618的相对表达量 切除NSCLC组织及远离肿瘤边缘5 cm左右的癌旁组织，以组织匀浆机研碎后，加入1 mL TRIzol裂解液，之后加入200 μL氯仿后震荡混匀静置5 min，在低温下(4℃)以12000 r/min的转速离心30 min，吸取适量上层水相层溶液与等量的异丙醇混匀，在低温下(4℃)以12000 r/min的转速离心15 min，无水乙醇洗涤沉淀两次，加入DEPC水溶解RNA。Nondrop 2000检测RNA浓度，将总RNA按逆转录试剂盒说明书逆转为cDNA。

miR-618引物F:3′-TGCTCTTGTTCACAGCCAAA-5′, R: 3′-GGTGATGCCA ATAACCCATC-5′；内参F:5'-CTCGCTTCGGCAGCACAING1-3′, R:5′-AACGCTTCACGA ATTTGCGT-3′。以cDNA作为模板进行qRT-PCR。每个样品设置3个反应复孔，反应条件: 95 ℃预变性5 s，95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s 共计40 个循环，分析各样品的循环阈值(threshold cvcle, Ct)，用2-ΔΔCt法分析目的基因相对表达量。

3 随访 所有患者在术后均进行随访，随访方式为电话及门诊的方式进行定时随访，随访终点事件为为患者死亡或者随访时间达到60个月。

三、统计学分析

结 果

一、qRT-PCR检测miR-618在NSCLC组织中的表达水平

qRT-PCR检测miR-618在85例NSCLC组织和癌旁组织中的表达情况。结果显示：miR-618在NSCLC组织中的平均表达水平为(0.78±0.48)，显著低于癌旁组织(0.99±0.57)(配对检验t=2.653,P=0.009)。

二、NSCLC组织中miR-618的表达水平对患者预后的影响

根据上述检测结果，将miR-618表达水平>0.78定义/划分为miR-618高表达组(n=39)，≤0.78定义/划分为miR-618低表达组(n=46)。对miR-618高、低表达两组进行预后分析：以Kaplan-Meier绘制患者生存曲线，Log Rank检验分析结果。显示：miR-618低表达的NSCLC患者的术后5年总生存率为15.22%(7/46)，显著低于miR-618高表达的NSCLC患者的33.33%(13/39)，差异具有统计学意义(χ2=29.50，P=0.000)，且miR-618低表达组中位OS<28 个月，而miR-618高表达组中位OS>36 个月，miR-618低表达患者的术后OS比高表达患者显著缩短(P<0.05)，即高表达的miR-618，可能是患者预后的积极影响因素(见图1)。

图1 NSCLC患者癌组织中miR-618的表达水平与患者术后OS的关系

三、miR-618在NSCLC组织中的表达水平与患者临床病理参数之间的关系

分别计算比较各临床病理指标不同水平层的miR-618表达水平，发现miR-618在NSCLC组织中的表达量差异与患者的年龄、性别、组织类型均无关(P>0.05)，而与肿瘤大小、分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关(P<0.05)(见表1)。

再对miR-618高、低表达两组，分别比较其在各临床病理指标不同水平层中的占比，发现其结果同上，即miR-618在NSCLC组织中的表达高低差异与患者的年龄、性别、组织类型均无关(P>0.05)，而与肿瘤大小、分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关(P<0.05)(见表1)。

结合数据看：肿瘤大小≥3 cm患者miR-618表达低于<3 cm者，低分化患者miR-618表达低于高分化者，肿瘤分期Ⅲ ～ Ⅳ患者miR-618表达低于Ⅰ～Ⅱ者，有淋巴结转移患者miR-618表达低于无淋巴结转移者。

表1 miR-618在NSCLC组织中的表达水平与临床病理参数之间的关系

四、NSCLC患者miR-618的表达水平的影响因素分析

进一步建立非条件Logistic回归模型，以NSCLC miR-618表达水平为应变量，赋值1=高表达(>0.78)，0=低表达(≤0.78)。以前述(表1)中P<0.10的指标/因素为自变量，初选了肿瘤大小等4个指标作为自变量。各变量赋值参见(表2)。回归过程采用逐步后退法，以进行自变量的选择和剔除，设定α剔除=0.10，α入选=0.05。回归结果：4个变量均被保留入回归方程(P<0.05)。提示：肿瘤大小、分化程度、TNM分期及淋巴结转移均是miR-618表达水平的显著影响因素(见表2)。

讨 论

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤，其死亡率位居我国肿瘤相关死亡的第一位，严重危害人们生命健康，且近年来由于不良的生活习惯、工作压力和环境的恶化等因素，肺癌的发病率仍具有上升趋势[15]。肺癌具有两种重要的组织类型，NSCLC和SCLC，两者的治疗方法不同，手术是NSCLC的主要治疗手段，但是NSCLC晚期患者由于发生转移，使得手术切除受限，且NSCLC对于化疗和放疗具有抵抗性，NSCLC的预后仍然不容乐观。目前肿瘤的治疗将进入精准靶向治疗的时代，直接靶向肿瘤发生发展中关键分子可提高治疗疗效，具有与NSCLC治疗和预后相关分子标记物的研究获得越来越多的关注[16-17]。NSCLC具有肿瘤异质性，发病过程错综复杂，其发生发展的具体分子机制仍未完全明确，因此在分子水平研究NSCLC发病过程中具有重要作用的分子，可能为NSCLC提供新的治疗策略。

表2 NSCLC患者miR-618的表达水平的Logistic回归结果

MiRNAs是研究最为广泛的非编码RNA，miRNAs属于单链小RNA，长度为17～25个核苷酸，不能编码蛋白质，通过与靶基因的3'非翻译区(3'-UTR)结合负调控靶基因的表达[7-8]。miRNAs可充当致癌基因或肿瘤抑制因子，调控多条信号通路，在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用，越来越多的研究报道miRNAs可作为药物靶点，具有治疗肿瘤的潜能[10-11]，NSCLC中同样存在异常表达的miRNAs[18-19]，miR-618为新近报道的miRNA，其异常表达可引起扩张性心肌病[20]和人类恶性肿瘤等疾病的发生[12-14]，已有的关于miR-618报道中，在肿瘤方面的研究相对较多，Shi等[12]采用qRT-PCR 检测发现miR-618在胃癌组织中表达下调，并通过靶向TGF-β2抑制胃癌细胞的侵袭和迁移能力；miR-618在转移性雄激素非依赖性前列腺癌中表达下调，miR-618低表达的患者预后较差，敲低miR-618的表达促进前列腺癌细胞迁移和侵袭，并诱导上皮细胞向间充质细胞的转化[13]；miR-618在甲状腺癌中表达下调，过表达miR-618通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制甲状腺细胞增殖并诱导G2/M期细胞阻滞[14]。多个研究已经证实miR-618发挥的抑癌因子的作用，miR-618在NSCLC中发挥的作用尚未明确。本文采用qRT-PCR检测miR-618在85例NSCLC组织和癌旁组织中的表达水平，发现miR-618在NSCLC组织中的表达水平低于癌旁组织，表明在NSCLC中miR-618可能是抑癌因子。

本研究分析了NSCLC中miR-618表达的临床意义及其影响关系。考虑到NSCLC的发病率和死亡率均可能与患者年龄、性别、组织类型、肿瘤大小、分化程度、TNM分期和淋巴结转移均有关，因此检测分析miR-618的表达在NSCLC患者各临床病理特征分层中的差异，对miR-618不同表达水平组进行Kaplan-Meier生存分析。结果显示：miR-618低表达的NSCLC患者的术后5年总生存率显著低于miR-618高表达的NSCLC患者，miR-618低表达组中位OS<28个月，显著低于miR-618高表达组中位OS>36个月。说明miR-618的表达与患者的预后密切相关，高表达对患者预后有积极影响。

进一步通过单因素和多因素Logistic回归，发现miR-618的表达水平与患者的年龄、性别、组织类型无关，与肿瘤大小、分化程度、肿瘤分期及淋巴转移等因素密切关联(P<0.05)，提示它们均是miR-618表达的影响因素。结合数据看：肿瘤大小≥3 cm患者miR-618表达低于<3 cm者，低分化患者miR-618表达低于高分化者，肿瘤分期Ⅲ ～ Ⅳ患者miR-618表达低于Ⅰ～Ⅱ者，有淋巴结转移患者miR-618表达低于无淋巴结转移者。

综上所述，miR-618在NSCLC中表达下调，与肿瘤大小、分化程度、TNM分期和淋巴结转移及预后相关，具有重要的临床意义，可能是肿瘤治疗的潜在靶点。