基因芯片技术检测分枝杆菌和IFN-γ测定对结核性胸膜炎的诊断价值

林秀华 叶嘉 张雷 周晓 赖国祥 陈雨燕

自基因芯片技术应用于分枝杆菌的菌种鉴定后，逐渐成为临床诊断结核病与非结核分枝杆菌病的一项新技术。与传统方法相比，基因芯片技术具有快速、简便、高灵敏度、高特异性、重复性好、通量高等优势[1-2]；胸腔积液IFN-γ水平已被证实在结核性胸膜炎患者中具有一定的诊断价值[3-4]。本研究探讨胸腔积液中基因芯片技术检测分枝杆菌和IFN-γ测定对结核性胸膜炎的诊断价值。

资料与方法

一、临床资料

1 研究对象 选取2013年9月至2016年11月福建省福州肺科医院及中国人民解放军联勤保障部队第900医院收治的260例胸腔积液患者为研究对象，本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。其中经胸膜活检、胸腔镜活检及实验室检查确诊为结核性胸腔积液者120例，非结核性胸腔积液140例。两组年龄、性别等一般资料具有可比性(P>0.05)(见表1)。

表1 两组患者一般资料比较(n,%)

2 诊断标准 (1)结核性胸膜炎(TPE)符合中华医学会结核病学分会颁布的《肺结核诊断和治疗指南》[5]中有关结核性胸膜炎诊断标准，符合至少以下3条标准者：①有发热、盗汗、乏力、消瘦等结核中毒症状及咳嗽、胸痛、胸闷、气促等；②超声、X线胸片或胸部CT证实有可抽取的胸腔积液；③胸水检出抗酸杆菌；④胸膜活检病理提示结核肉芽肿；⑤胸部影像学提示结核病灶；⑥抗结核治疗2个月后症状改善，胸水较前吸收；⑦治疗后随访半年无复发。(2)恶性胸腔积液组 影像学检查提示有胸腔积液，胸膜活检病理提示恶性病变，或者经皮肺穿刺活检或支气管镜检查证实为肺癌，且胸水脱落细胞中可见恶性细胞(≥2次)。(3)类肺炎性胸腔积液组：患者有咳嗽、咳痰、发热、胸痛等症状，影像学检查可见肺部斑点、斑片、片状实变影，边界模糊，血白细胞及中性粒细胞升高，胸水培养见细菌，抗感染治疗后胸水明显吸收。

3 排除标准 ①严重心、肝、肾等脏器疾病者；②排除糖尿病、自身免疫性疾病等影响免疫功能的疾病；③并发其他特殊感染，如人类免疫缺陷病毒等；④治疗前4周内未使用激素及免疫抑制剂；⑤妊娠及哺乳期妇女；⑥伴有认知功能障碍者。

二、方法

1 主要仪器及试剂 IFN-γ试剂盒(武汉基因美科技有限公司)、北京博奥生物有限公司生产的分枝杆菌菌种鉴定芯片及Lux ScanTM10K/B 微阵列芯片扫描仪等配套仪器。

2 标本收集及指标检测 (1)以标准的胸腔穿刺术或胸腔闭式引流术，抽取新鲜胸腔积液10 mL，抽出后立即冰浴，4℃离心10 min，取上清液冻存于-80℃冰箱待检。按照试剂盒说明书采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法检测受试者胸腔积液中IFN-γ浓度。(2)取胸腔穿刺术或胸腔闭式引流术时留存的胸腔积液标本400μL，加入1.5 mL离心管中，加入等量的10%氢氧化钠，震荡混匀1～3 min，室温静置15 min。然后按基因芯片试剂盒说明书的操作流程顺序进行，包括核酸提取、PCR扩增、芯片杂交、芯片洗涤、芯片扫描。

3 统计学处理

结 果

一、各组患者胸腔积液中IFN-γ水平

1 各组患者胸腔积液中的IFN-γ水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，其中结核性胸膜炎组患者胸腔积液中IFN-γ水平明显高于其他2组，差异有统计学意义(P<0.01)(见表2)。

表2 各组患者胸腔积液中IFN-γ水平

2 胸腔积液中IFN-γ对结核性胸膜炎的诊断价值 胸腔积液中IFN-γ的ROC曲线(见图1)。以58.0pb/ng·L-1为最佳临界值，ROC曲线下面积(area under curve, AUC)为0.98，敏感度为78.2%，特异度为94.4%。

二、各组患者胸腔积液中基因芯片法测分枝杆菌结果

应用基因芯片法检测各组患者胸腔积液中分枝杆菌，差异无统计学意义(χ2=2.351,P=0.309)(见表3)。

图1 胸腔积液中IFN-γ的ROC曲线

表3 基因芯片法测各组胸腔积液中分枝杆菌结果(例)

讨 论

分析胸腔积液中IFN-γ对结核性胸膜炎的诊断价值时发现：胸水IFN-γ 诊断结核性胸膜炎的ROC曲线下面积为0.98，敏感度为78.2%，特异度为94.4%，提示胸腔积液中IFN-γ的浓度是结核性胸膜炎与其他原因引起的胸腔积液鉴别时的一个有用的指标。但综合国内外研究[13]可以发现各研究中胸腔积液的IFN-γ浓度差别较大，导致其敏感性、特异性也有差异，可能与疾病所处的病程及严重程度不同有关，因为同一种疾病的不同阶段产生的细胞因子浓度可能不同；也可能与选取的对照组人群不同有关。另外，不同研究对象对结核分枝杆菌的免疫应答可能也存在个体差异。故仍需积极探索、寻找其他简便、安全、敏感、特异性高、重复性好的免疫生物学标记物，以期在临床上开展联合检测，提高敏感度及特异性，争取早期诊断，从而改善患者预后。

基因芯片法的基本原理是首先将检测菌的DNA/RNA提取出来，对样品中的靶基因进行扩增和荧光标记，将靶基因与芯片上的探针进行反向斑点杂交反应，最后芯片扫描成像，用配套软件进行判读。根据探针在芯片上的特定位置排布，推断出相应被测细菌的相关信息，具有灵敏度高、特异性好、快速简便、可重复性强、高通量等优点，为结核性胸膜炎的早期快速诊断提供了一种新的思路。但本研究结果显示，结核性胸膜炎组患者应用基因芯片法检测胸腔积液分枝杆菌与恶性胸腔积液组及类肺炎性胸腔积组无统计学差异，笔者推测可能跟结核性胸膜炎的发病主要为迟发型变态反应及局部免疫应答有关，与临床上结核性胸腔积液涂片找抗酸杆菌、结核菌培养及结核杆菌DNA多为阴性一致，确切机制有待于将来更大样本量更深入的研究。根据目前的研究结果，笔者不建议将基因芯片法行胸腔积液分枝杆菌菌种鉴定应用于结核性胸膜炎的诊断中。

综上所述，胸腔积液中IFN-γ检测可作为鉴别结核性胸膜炎的一种免疫生物学标志物，但基因芯片法行胸腔积液分枝杆菌菌种鉴定对结核性胸膜炎的诊断价值尚需进一步研究证实。