山药多糖和大豆多肽对复合益生菌发酵特性的影响

陈则华，李文治，赖玉健，黄剑钊，黎攀，杜冰*

1. 无限极（中国）有限公司（广州 510663）；2. 华南农业大学食品学院（广州 510642）

益生元又称双歧因子，能够促进其体内有益菌的代谢和增殖，改善宿主健康[1]。目前已经开发的益生元种类有低聚糖[2]、多糖[3]、植物中草药提取物[4]、蛋白质水解物[5]和多元醇等，种类有限，开发更多类型的新型益生元势在必行。山药多糖是从山药里提取出来的一种多糖，由单糖基通过糖苷键连接而成的高分子聚糖。山药多糖具有一定的生物活性，如具有抗氧化、维持肠道稳态、免疫调节[6]、降血糖、保护肝脏等生理功能，易被机体消化、代谢，无毒副作用。有研究显示，长期灌胃山药多糖可以促进实验动物的生长性能和影响肠道菌群[7]，山药低聚糖对青春双歧杆菌和动物双歧杆菌的生长有促进作用[8]。大豆多肽是大豆蛋白经蛋白酶水解以后产生的一种蛋白质水解产物，具有高营养、易吸收、低抗原、不会引起过敏反应等功能特性，还具有一定的抗氧化和调节免疫力等生理功能[9]。有研究表明，大豆蛋白中的水解产物[10]能够促进双歧杆菌增殖，潘芬等[5]研究发现添加4 mg/mL的豌豆蛋白酶解产物能够显著促进干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌等益生菌的生长。可见，山药多糖和大豆多肽均具有较好的生理功能，容易被机体吸收，都有抗氧化和提高免疫力等功能，具备成为潜在益生元的天然条件。

试验以山药多糖、大豆多肽为研究对象，通过观察复合益生菌生长过程中活菌数、pH、总酸和短链脂肪酸4个指标，并与传统益生元菊粉作对比，来探讨山药多糖和大豆多肽作为新型益生元的可能性。

1 材料和方法

1.1 试验材料

山药多糖（由广州南北行中药饮片有限公司山药片提取）；大豆多肽（由本实验室对市售大豆提取）；菊粉（纯度＞90%）：重庆骄王天然产物股份有限公司；鼠李糖乳杆菌R11（1 500亿 CFU/g）、嗜酸乳杆菌R418（1 500亿 CFU/g）和动物双歧杆菌乳亚种B94（1 000亿 CFU/g），拉曼公司，复配比例为1︰1︰1.5；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PHS-25型pH计（上海精密科学仪器有限公司）；FA1104N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；YXQ-LS-5OS型立式蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；SW-CJ-1D型单人净化工作台（苏州净化设备有限公司）；GHX-9270B-2隔热式恒温培养箱（上海福玛实验设备有限公司）；101-2S4电热鼓风恒温干燥箱（上海迅能电热设备有限公司）；Agilent 6890N高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）。

1.3 发酵培养基

肠道菌群发酵培养基（General Anaerobic Medium，GAM）配方：蛋白胨10 g，大豆胨3 g，消化血清粉13.5 g，酵母浸膏5 g，牛肉膏2.2 g，牛肝膏1.2 g，葡萄糖3 g，KH2PO42.5 g，NaCl 3 g，可溶性淀粉5 g，L-半胱胺酸盐0.3 g，硫乙醇酸钠0.3 g，琼脂1.5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.4，于110 ℃灭菌25 min。

1.4 试验方法

1.4.1 益生菌复合发酵

以菊粉为对照，在葡萄糖的肠道菌群发酵培养液（GAM）中，分别加入0.5%，1%，1.5%，2%浓度的山药多糖和大豆多肽；并按照106CFU/mL接种量，接入含有鼠李糖乳杆菌R11、嗜酸乳杆菌R418和动物乳双歧杆菌B94三种复合益生菌，于37 ℃厌氧发酵24 h。

1.4.2 复合益生菌活菌数的测定

采用平板计数法[11]测定发酵液菌落数。

1.4.3 复合益生菌发酵液pH的测定

采用pH计测定发酵液的pH。

1.4.4 复合益生菌产生总酸和短链脂肪酸含量测定

采用电位滴定法[12]测定发酵液中的总酸含量；同时，选取1%添加浓度的发酵液用0.22 μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法（HPLC）测定发酵液中乳酸、乙酸的含量。HPLC测定短链脂肪酸含量的方法：色谱柱，HP-INNOWAX（19091N-133）；毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm）；检测器，离子化火焰检测器；载气N2，流速20 mL/min；检测器温度270℃；气化室温度250 ℃。升温程序：120 ℃→10 ℃/min→220 ℃。

2 结果与分析

2.1 益生元对复合益生菌增殖能力的影响

由图1可知，在培养24 h后，相对于空白对照（即益生元添加浓度为0），3种不同的益生元均可以提高益生菌的活菌数，其中添加了菊粉对益生菌的增殖作用最优，山药多糖次之，大豆多肽较弱，而且每种益生元对于提高益生菌活菌数所需要的添加浓度和规律性不尽相同。对于山药多糖，随着添加浓度的增加，促进复合益生菌增殖的能力呈现先下降后上升的趋势，当添加浓度为2.0%时，促进益生菌增殖效果最优。有研究[7]报导，高剂量组的山药多糖喂养小鼠促进肠道内乳酸杆菌、双歧杆菌增殖的效果比中剂量组和低剂量组的好，与此次试验结果相似。对于大豆多肽，则呈现出先上升后下降的趋势，当添加浓度为0.5%时，促进复合益生菌增殖效果最优。而传统益生元菊粉，已有大量报导其具有促进益生菌增殖的功效，此次试验中除了最低浓度的添加量外，其余组均能促进益生菌增殖。

图1 不同浓度益生元对复合益生菌活菌数的影响

2.2 益生元对复合益生菌pH的影响

由图2可知，当发酵24 h后，添加3种不同的益生元均能降低发酵液的pH，其中菊粉对pH的降低效果最佳，山药多糖次之，大豆多肽较弱，而且随着益生元浓度的增加，3种发酵液的pH均呈现先下降再上升的趋势，当添加浓度为1.0%时降低的效果最优。

图2 不同浓度益生元对复合益生菌pH的影响

2.3 益生元对复合益生菌产酸能力的影响

由图3可知，发酵液培养24 h后，3种益生元均能提高复合益生菌的总酸含量，其中菊粉提高的效果最佳，大豆多肽次之，山药多糖较弱。当添加浓度为1.0%时，对复合益生菌产酸的效果最好。

2.4 不同益生元对复合益生菌短链脂肪酸产生量的影响

试验还分析了总酸中短链脂肪酸的产生量，高效液相色谱（HPLC）检出图谱如图4所示。

选取添加量为1.0%的益生元的发酵液检测，测定乳酸和丁酸的含量。由图5可知，添加山药多糖、大豆多肽和菊粉均能使复合益生菌产生较多的乳酸和乙酸，其中添加山药多糖、大豆多肽益生元的发酵液产乳酸量比菊粉的高，分别高1.71和1.83倍，但略比空白对照低；添加山药多糖和大豆多肽的发酵液产乙酸量比添加相同量菊粉和空白组的都高，分别达0.049和0.083 g/100 g。

图3 不同浓度益生元对复合益生菌产生总酸能力的影响

图4 乳酸（A）和乙酸（B）的HPLC检出图

图5 不同益生元对复合益生菌产短链脂肪酸含量的影响

3 讨论

短链脂肪酸是肠道微生物发酵未消化的碳水化合物如纤维多糖和寡聚糖等益生元而产生的主要代谢产物，包括乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等有机脂肪酸[13]，对宿主肠屏障功能的维护有重要作用。短链脂肪酸在体内参与众多不同器官的代谢，每种脂肪酸都有特定的功效。乳酸可降低肠道内环境的pH，对肠道致病菌如沙门氏菌（Salmonella）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）等有抑制作用，还能促进肠道蠕动，调节肠道菌群的平衡[14]。乙酸是发酵膳食纤维的主要代谢产物[15]，可以通过血液作用于全身多个器官和组织，经过肝脏代谢吸收利用，为底物氧化、脂质合成和肝细胞代谢提供充足的能量[16]。然而，不同种类的益生元促进益生菌产生的短链脂肪酸的种类和含量存在显著差别。Satoh等[17]指出，不同的益生元促进益生菌产生乳酸含量不一样，低聚半乳糖、大豆低聚糖等促进双歧杆菌产生乳酸的量比低聚木糖、低聚乳果糖等益生元的高。

有研究报道：菊粉是目前研究最深、应用最广的益生元，它可以促进短链脂肪酸丁酸的产生[18]，丁酸盐可以选择性诱导结肠癌细胞的死亡[19]，从而具备维护肠道健康、改善肠道微生态的功效。此次试验中，在添加了山药多糖和大豆多肽后，都能促进复合益生菌产酸量，虽然总酸的产生量没有传统益生元菊粉高，但是产生的乳酸和乙酸含量都比菊粉高，说明山药多糖和大豆多肽在促进短链脂肪酸的产生中具有较大的优势。短链脂肪酸在机体内的代谢吸收作用对人体产生重大的作用，目前已有大量的研究[20]报导了短链脂肪酸的代谢通路和功效。

4 结论

山药多糖和大豆多肽均能促进复合益生菌的生长并提高其短链脂肪酸的产生，说明其具备进一步为开发新型益生元的潜在优势。