杏鲍菇菌糠制备氨基酸水溶肥

陆欢，徐宁*，王小艳，王春晖，彭运祥，夏姣

1. 湖南省食用菌研究所（长沙 410013）；2. 涟源市食品药品监督管理局（娄底 417199）

食用菌采收后剩余的废弃培养料称为菌糠，与原始培养料相比，其粗纤维含量大幅度降低，粗蛋白含量显著提高，且富含多种微量元素。近年来，我国食用菌产业发展迅速，2017年全国食用菌总产量为3 712万 t，杏鲍菇159.71万 t，菌糠年生产量在2×108t以上。这些菌糠除少部分被循环利用为食用菌培养料外，往往被丢弃或燃烧，不但造成资源浪费，同时还导致霉菌和害虫的滋生，污染环境。目前，食用菌菌糠的资源化利用已受到广泛关注，已报道的利用途径不下10种[1-13]，但大多数研究还不够深入，未在生产实践中得到广泛推广。

水溶肥料是指能够完全溶于水的多元素复合型、速效性肥料，可以完全溶解于水中，能被作物的根系和叶面直接吸收利用，可水肥同施，以水带肥。近年来，水溶肥料产业发展迅速，与传统的复合肥等相比，有效吸收率高，肥效快，可解决高产作物快速生长期的营养需求。近年来，氨基酸作为小分子有机物质，不仅能促进植物生长发育、增强抗逆性、改善土壤状况、提高作物产量和改善品质，还能减轻植物重金属离子毒害、钝化病原菌毒素等[14-16]，具有很好的经济和生态效应。

腐熟后的菌糠采用酶法结合微波提取法制备氨基酸水溶肥，是在利用菌糠生产肥料的基础上，通过酶解过程释放出更多的游离氨基酸和营养物质。氨基酸水溶肥是一种高效安全肥料，菌糠为氨基酸的生产来源提供了很好的资源，而不再局限于皮革、毛发这类原料。因此，氨基酸肥料的研究和应用，是目前肥料发展的重要方向，此次研究为菌糠制备氨基酸水溶肥开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杏鲍菇菌糠（产地湖南），晒干粉碎后，腐熟发酵备用。

风味酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

D 101大孔树脂（天津）；电子天平；旋转蒸发仪；H 1850 R离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；HWS-26恒温水浴锅（苏州江东州精密仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 游离氨基酸提取方法

称取50 g腐熟菌糠，按照料液比1︰20（g/mL）加入蒸馏水，充分浸泡3 h，分离出浸液，取滤渣按照料液比1︰20（g/mL）加入蒸馏水，充分浸泡3 h。2次浸泡处理水的温度均保持为70 ℃，每间隔10 min进行搅拌，并在搅拌后进行微波处理3 min。冷却后加酶控温40 ℃反应5 h，然后升温至90 ℃灭酶活20 min。以12 000 r/min离心5 min，过滤，收集滤液，过大孔树脂除去色素，滤液按浓缩比1︰10（g/mL）通过回旋蒸发仪浓缩滤液。冷却后加入无水乙醇进行醇沉，过夜，离心后取上清液，用茚三酮比色法测游离氨基酸。

1.3.2 酶种类及复合比例筛选

酶种类筛选：选择风味酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶进行单酶和复合酶的配比，酶添加总量为0.5%，以可溶性固形物和游离氨基酸为指标，选择提取效果最好的单酶或复合酶进行复合酶比例的筛选。

1.3.3 酶反应条件优化

确定复合酶用量后，对反应时间和温度进行优化。以游离氨基酸为指标筛选最佳反应条件，试验安排见表1。

表1 酶反应条件

1.3.4 减压蒸馏工艺优化

滤液浓缩选择蒸馏时间、蒸馏温度为自变量，以固形物为参考指标，平行取样重复3次，取平均值。以滤液为原料，蒸馏温度120 ℃，选择在蒸馏时间10，20，30，40，50和60 min下进行蒸馏；蒸馏时间30 min，选择在蒸馏温度100，110，120，130和140℃下进行蒸馏。

根据蒸馏时间、蒸馏温度单因素试验结果设计均匀试验，以固形物为参考指标，观察各组合浓缩效果，因素水平表见表2。

表2 均匀试验因素水平

2 结果与分析

2.1 酶种类对氨基酸含量的影响

采用风味酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶分别对腐熟菌糠进行氨基酸提取，结果见表3。在单酶作用下，添加风味酶进行提取，可溶性固形物含量最高，添加木瓜蛋白酶提取，游离氨基酸含量最高。将3种酶中的任意2种分别按1︰1比例复合后进行提取试验，结果显示，风味酶与木瓜蛋白酶复合有利于提高氨基酸含量，木瓜蛋白酶和纤维素酶复合有利于提高可溶性固形物。将3种酶按1︰1︰1比例复合进行提取，结果不仅有利于提高氨基酸含量，还有利于增加可溶性固形物。将风味酶和木瓜蛋白酶以1︰1（1指添加量为0.25%）的比例作为一个整体，在与纤维素酶进行不同比例复合，结果见表3。结果表明，3种酶其余比例相较于比例为1︰1︰1，添加量为0.5%时的氨基酸增加量并不明显，但酶添加量增多，成本加大。因此，生产时选择复合酶添加比例为1︰1︰1，总添加量为0.5%更为合适。

表3 不同酶对游离氨基酸提取效果的影响

2.2 酶反应条件优化结果

对表1中4种反应条件下得到的提取液中游离氨基酸进行分析，结果见表4。提取条件1，即提加酶后40℃反应2 h，再提高至50 ℃反应2 h，氨基酸含量较高；取条件2，即加酶后50 ℃反应4 h，上清液中游离氨基酸含量最高，可见50 ℃酶反应有利于氨基酸释放；提取条件4，即不加酶50 ℃提取4 h，氨基酸含量最低。因此，加酶50 ℃反应4 h有利于氨基酸的提取。

2.3 减压蒸馏工艺优化

2.3.1 蒸馏时间对游离氨基酸含量的影响

蒸馏时间对提取液浓缩后游离氨基酸含量的影响比较明显。由表5可知，在10～30 min范围内，随着时间的增加，游离氨基酸释放量增大。在30 min以后，随着时间继续延长，蒸馏时间对氨基酸释放量影响不显著，氨基酸含量没有显著差异，原因可能是后期因水分已被大量蒸发，多糖等含量增加导致稠度加大，不利于氨基酸释放，因此蒸馏时间宜设定为20～40 min。

表5 蒸馏时间对游离氨基酸含量的影响

2.3.2 蒸馏温度对游离氨基酸含量的影响

蒸馏温度对提取液浓缩后游离氨基酸含量影响比较复杂，不同温度对游离氨基酸释放量有完全不同的影响。由表6可知，在10～120 ℃范围内，随着温度的升高，游离氨基酸含量增大。在120 ℃以后，随着温度升高，游离氨基酸含量增加不显著。原因可能是温度增加破坏了浓缩液中所含物质的结构活性，影响氨基酸释放量。

表6 蒸馏温度对游离氨基酸含量的影响

2.3.3 减压蒸馏均匀试验结果

根据单因素的试验结果，以蒸馏温度、蒸馏时间2个因素，选取因素水平进行均匀试验，结果见表7。组号5的氨基酸含量最高，通过3组平行试验验证，氨基酸含量分别为13.57，13.62和13.70 g/L。由验证试验结果可知：适宜水平组合为A2B2，即最适条件选取为蒸馏时间30 min、蒸馏温度120 ℃。

表7 均匀试验方案与结果

3 结论与讨论

菌糠制作有机肥的研究较少，且对氨基酸水溶肥的制备研究少有报道，而菌糠富含丰富的营养成分，值得综合开发利用。试验对复合酶+微波法提取腐熟菌糠中的游离氨基酸进行了研究。结果表明0.5%复合酶（风味酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶以1︰1︰1的比例复合）提取后效果最好，提取得到的游离氨基酸含量达到14.89 g/L。酶反应条件优化研究结果表明，加酶后先50 ℃反应4 h效果最佳，分析原因可能是酶提一段时间后，游离氨基酸溶出速率稳定，继续升温酶反应对于其游离氨基酸含量增加影响不大。结合酶种类（风味酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶以1︰1︰1的比例复合），得到的游离氨基酸含量为13.02 g/L。减压蒸馏通过单因素试验的结果得出，蒸馏时间的范围宜设定为20～40 min，蒸馏温度的范围宜设定为100～120℃。由均匀试验结果分析可得到最优组合，再通过验证试验综合分析可知，适宜水平组合为A2B2，即蒸馏时间30 min，蒸馏温度120 ℃，得到的游离氨基酸含量为13.64 g/L。试验为菌糠制备水溶肥提供了参考，具有一定的指导意义。