花椒中抗AchE活性物质的提取工艺

许静，戴妙妙，魏蒙月，张赟彬, *，黄润宇，王思佳

1. 上海应用技术大学香料香精技术与工程学院（上海 200234）；2. 上海市质量监督检验技术研究院（上海 201114）；3. 上海中侨职业技术学院食品学院（上海 201319）；4. 上海中医药大学公共健康学院（上海 201210）

阿尔兹海默病（AD）是一种由多因素共同导致的中枢神经系统退行性疾病[1-2]。在众多假说中以乙酰胆碱酶（AchE）水解神经递质导致胆碱能活性下降的“胆碱能学说”和AchE诱导大脑细胞外Aβ沉积的“β-淀粉样蛋白学说”得到广泛支持[3-4]，这2种学说都表明AchE在AD的形成中起到至关重要的作用。在《阿尔茨海默病2018年报告》指出AD在老年人群体的发病率仅次于心血管、肿瘤等老年性疾病，到2050年，全球AD患者预计约1.5亿人[5]。AD不仅严重影响老年人健康，还给患者家庭和社会带来沉重负担[6]。因此，AchE抑制剂的开发具有重大意义。

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim），茴香科花椒属，是中国的传统调味香辛料，在中国主要分布于长江流域及其南部地区[7]。近年来花椒的医用价值受到广泛关注，其中已被分离鉴定出富含有生物碱、香豆素、酰胺、黄酮和木质素等活性成分[8-9]，药理研究表明这些活性成分具有显著的抗氧化[10]、抑菌[11]、抗癌[12]、抑制血小板凝集等[13]生物活性功效。Chen等[14]研究发现四川花椒的95%乙醇提取物分离得到的异丁基羟酰胺可提高皮质酮损伤PC12细胞存活率，对神经系统具有保护作用。张锋等[15]对D-半乳糖致衰老模型小鼠用不同剂量的花椒多酚类化合物（ZPPC）总提取物进行灌胃处理，发现ZPPC处理组小鼠脑组织SOD活力值上升，明显改善小鼠的学习记忆能力。此外，有报道指出从花椒属植物分离的吖啶类生物碱在体外表现出一定细胞毒活性和抗疟活性[16-17]。关于花椒活性物质提取及其功效研究已有不少报道，但从花椒中提取抗AchE活性物质的研究仍鲜见相关报道。因此，以花椒为原料，以改良的Ellman比色法为测定方法，在单因素试验基础上，设计正交试验优化花椒中抗AchE活性物质的提取条件参数，为寻找新的AchE抑制剂来源和新型AD治疗药物研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

花椒粉（上海味好美食品有限公司）；AchE（5 00 U 2 mg）、碘代硫代乙酰胆碱（ATch）、二硫二硝基苯甲酸（DTNB）（美国Sigma公司）；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、乙醇、甲醇、乙酸乙酯（均为分析纯，上海泰坦科技股份有限公司）。

ME204E电子天平（托利多仪器上海有限公司）；DK-S24恒温数显水浴锅（常州翔天试验仪器厂）；EMS-20磁力搅拌油浴锅（乔跃电子上海有限公司）；KQ-50DE超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；BUCHI R-2真空旋转蒸发仪（Buchi试验室设备贸易上海有限公司）；酶标仪（岛津中国有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 花椒中抗AchE活性物质的提取

准确称取10 g花椒粉于锥形瓶中，加入一定体积分数提取溶剂，于37 ℃水浴浸提60 min，回流提取，提取物过滤后旋蒸、冷冻干燥，干燥后样品用PBS缓冲液稀释至1.0 mg/mL，用于AchE抑制活性测定。

1.2.2 AchE抑制活性的测定[18]

试验在96孔酶标板上进行，设有空白组，空白对照组，测试组和测试对照组，每组做3个平行。试验组在96孔板中依次加入100 μ L PBS缓冲溶液、100 μ L样品提取液、10 μL 2.0 U/mL AchE，混合均匀后在37 ℃培养20 min，取出后依次加入20 μL 0.6 mmol/L DTNB、20 μ L 0.6 mmol/L ATch，于37 ℃反应20 min后在412 nm下测定吸光度。试验对照组用10 μ L的pH 8.0缓冲液代替10 μL的2.0 U/mL AchE溶液（扣除试验样品本身颜色影响）。空白组用100 μL的PBS缓冲溶液代替100 μ L样品提取液。空白对照组用100 μ L磷酸缓冲液代替100 μ L样品提取液、10 μ L缓冲液代替10 μ L的2.0 U/mL AchE溶液。

通过OD值评估对AchE的抑制活性，并根据式（1）计算抑制百分数。

抑制率=[（空白组-空白对照组）-（试验组-试验对照组）]/（空白组-空白对照组）×100% （1）

1.2.3 花椒中抗AchE活性物质提取单因素试验

1.2.3.1 提取溶剂种类的选择

在料液比1︰12（g/mL）、提取温度70 ℃、提取时间120 min条件下，选择乙酸乙酯、甲醇、乙醇和蒸馏水，按1.2.1方法提取并测定花椒提取液的AchE抑制率。

1.2.3.2 乙醇体积分数的选择

在料液比1︰12（g/mL）、提取温度70 ℃、提取时间120 min条件下，选择50%，60%，70%，80%和90%不同乙醇体积分数，按1.2.1方法提取并测定花椒提取液的AchE抑制率。

1.2.3.3 提取时间的选择

在乙醇体积分数80%、料液比1︰12（g/mL）、提取温度70 ℃条件下，选择提取时间60，90，120，150和180 min，按1.2.1方法提取并测定花椒提取液的AchE抑制率。

1.2.3.4 提取温度的选择

在乙醇体积分数80%、提取时间90 min、料液比1︰12（g/mL）条件下，选择提取温度50，60，70，80和90 ℃，按1.2.1方法提取并测定花椒提取液的AchE抑制率。

1.2.3.5 料液比的选择

在乙醇体积分数80%、提取时间90 min、提取温度条件80 ℃下，选择料液比1︰9，1︰12，1︰15，1︰18和1︰21（g/mL），按1.2.1方法提取并测定花椒提取液的AchE抑制率。

1.2.4 花椒中抗AchE活性物质提取正交试验

依据单因素试验结果选取提取时间、乙醇体积分数、提取温度和料液比为考察的4个因素，每个因素选取3水平，以AchE抑制率为指标，设计L9(34)正交试验表进行正交试验，优化花椒中抗AchE活性物质的最佳提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 花椒中抗AchE活性物质提取单因素试验

2.1.1 溶剂种类对AchE抑制率的影响

由图1可见，当提取溶剂为乙醇时，AchE抑制率最高，为33.64%，甲醇提取液抑制率最低，为14.72%。乙醇是一种半极性溶剂，既能溶解生物碱类、苷类等极性溶剂所溶解的极性化合物，也能溶解挥发油、内脂等非极性溶剂所溶解的非极性化合物，且在中药材活性物质提取中乙醇是较理想的提取溶剂[19-20]。因此，在后续试验中提取溶剂选择不同提交分数乙醇溶液。

图1 溶剂种类对AchE抑制率的影响

2.1.2 乙醇体积分数对AchE抑制率的影响

由图2可知，乙醇体积分数在50%～80%范围内，花椒提取液的AchE抑制率随乙醇体积分数增加而增大，当乙醇体积分数为80%时，AchE抑制率达到最高值（41.60%）；当乙醇体积分数大于80%时，AchE抑制率有所降低。这可能是随着乙醇体积分数增加，抗AchE有效活性化合物浸出量增大，抑制率升高；而提取的抗AchE活性成分大多为极性物质[21-22]，乙醇体积分数继续增加，使溶液极性降低，极性成分浸出量减少，导致AchE抑制率降低。因此，花椒中抗AchE活性物质提取溶剂选取80%乙醇溶液。

图2 乙醇体积分数对AchE抑制率的影响

2.1.3 提取时间对AchE抑制率的影响由图3可知，随着提取时间延长，花椒提取液AchE抑制率呈先升后降趋势。提取时间在60～120 min范围内，AchE抑制率随提取时间延长而升高，当提取时间为120 min时，AchE抑制率达到最大（54.88%），随着时间继续延长，AchE抑制率下降。这可能是随时间延长，花椒中抗AchE活性物质得以充分浸出，但提取时间过长导致浸出物质分解失活，使有效活性成分损失。因此花椒中抗AchE活性物质最佳提取时间选取120 min。

图3 提取时间对AchE抑制率的影响

2.1.4 提取温度对AchE抑制率的影响

由图4可见，提取温度在50～80 ℃范围内，随着提取温度升高，AchE抑制率逐渐增大，当提取温度为80 ℃时，花椒提取液AchE抑制效果最佳，抑制率达到最大值（52.54%）；当提取温度大于80 ℃时，AchE抑制率下降。这可能是提取温度升高使花椒细胞壁破损，溶剂扩散渗透到细胞内的速率加快，有效活性成分充分析出，80 ℃时有效成分完全浸出达到浓度平衡，继续提高温度，浸出有效成分分子结构和理化性质因高温而受到破坏，导致AchE抑制率降低[23-24]。因此，花椒中抗AchE活性物质最佳提取温度选取80 ℃。

图4 提取温度对AchE抑制率的影响

2.1.5 料液比对AchE抑制率的影响

由图5可见，一定范围内料液比的增大有利于提高花椒提取液AchE抑制效果，花椒与80%乙醇溶液以1︰15（g/mL）料液比混合提取时，花椒提取液AchE抑制率最高，为58.22%。但随溶剂体积增加，AchE抑制率稍有下降，可能是花椒中抗AchE活性物质完全浸出，继续增加溶剂使杂质溶解量增加，影响花椒中抗AchE活性物质的提取效果。因此，从节约成本和提取效率方面考虑，花椒中抗AchE活性物质提取最佳料液比选取1︰15（g/mL）。

图5 料液比对AchE抑制率的影响

2.2 正交试验优化结果

根据单因素试验结果，以AchE抑制率为指标，确定花椒抗AchE活性物质提取的因素水平表，结果见表1。

表1 正交试验因素与水平

L9(34)正交试验设计及结果见表2。

由表2中R值大小可知，影响花椒中抗AchE活性物质提取效果的主次顺序为A＞B＞D＞C，即提取时间＞乙醇体积分数＞提取温度＞料液比，其中提取时间对花椒中抗AchE活性成分的提取效果影响最大，料液比对抗AchE活性成分的提取效果无明显影响，因此花椒提取工艺的最佳组合为A2B2C1D3。由于化学稳定性较差的浸出成分在过高的提取温度下可能被降解失活，而且温度越高，能源消耗和经济成本越大，综合考虑成本和提取效率，最终确定最优组合为A2B2C1D1，即乙醇体积分数80%，料液比1︰12（g/mL），提取温度70 ℃、提取时间120 min。

表2 花椒中抗AchE活性物质提取正交试验设计及结果

2.3 工艺验证

采用正交最优试验方案组合A2B2C1D1进行试验，结果测定AchE抑制率为67.42%，高于正交试验测定出的试验结果，说明试验采用的工艺条件合理，优化结果可靠。

3 结论

正交试验优化确定花椒中抗AchE活性物质提取的最佳工艺为：提取溶剂80%乙醇溶液，提取温度70℃、提取时间120 min、料液比1︰12（g/mL）。以最佳工艺组合提取的花椒提取液抑制率为67.42%。

采用乙醇回流提取法，通过正交试验优化花椒中抗AchE活性物质的提取工艺条件，建立从花椒中抗AchE活性物质的有效制备方法，为花椒中活性成分对阿尔茨海默病的治疗研究和阿尔茨海默病新型药物研发提供参考依据，为相关脑损伤发展和相关认知障碍提供研究方向。