颐脑解郁方对血管性痴呆模型大鼠P38-MAPK信号蛋白表达的影响

赵瑞珍赵子珺唐启盛

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是脑卒中后常见并发症之一，病人早期表现为近期记忆障碍，对新事物的学习能力减弱，随着病情进一步发展，远期记忆受损，一般事物的理解力和判断力变差，或出现其他精神状态改变。一项以医院人群为基础的队列研究发现，在脑卒中后3个月有17%～66%发生轻度认知障碍，其中26%～30%会在一年左右出现认知功能严重障碍，甚至发展为VD[1]。目前对于脑卒中后向VD转变的机制尚未有明确结论，近年来，国内外学者从信号通路角度对VD的发病机制进行了深入探讨，现已证实P38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)在脑卒中后病理变化和转归的过程中占有重要地位，对海马神经突触可塑性产生损伤，影响长时程增强 (long-term potentiation， LTP)这种突触可塑性形式[2]。本研究在前期研究的基础上，进一步探讨P38-MAPK信号蛋白在VD大鼠脑内的表达以及中药颐脑解郁方的干预作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级Wistar雄性大鼠体质量(200±10)g，实验动物许可证：SCXK(京)2012-0001。大鼠适应性喂养1周，温度22 ～25 ℃，相对湿度55%～65%，自由进食饮水，普通饲料饲养。

1.2 实验药品和试剂 细胞裂解液(北京Solarbio公司)；50x蛋白酶抑制剂混合物(北京凯基生物公司)；BCA蛋白含量检测试剂盒(北京凯基生物公司)；蛋白缓冲液(北京普利莱公司)；5xTris-甘氨酸电泳缓冲液(北京Solarbio公司)；10x电转液(北京Solarbio公司)；10x封闭-洗涤缓冲液(北京 Solarbio公司)；分离胶缓冲液(北京Solarbio公司)；浓缩胶缓冲液(北京Solarbio公司)；30%双丙烯酰胺溶液(北京Solarbio公司)；PAGE胶促凝剂(北京普利莱公司)；过硫酸铵(北京普利莱公司)；封闭专用脱脂奶粉(北京普利莱公司)；Western一抗稀释液(上海Beyotime公司)；PVDF膜(北京Millipore公司)；蛋白质分子量Marker(北京Thermo公司)；内参抗体(北京博奥森公司)；P38单克隆抗体(上海Cbcam公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(北京博奥森公司)；无水甲醇(天津进丰化学)；发光剂(美国GE Healthcare)等。

中药配方颗粒颐脑解郁方，组方：刺五加、郁金等(北京康仁堂药业有限公司)，按照灌胃剂量煎药浓缩，贮存于4 ℃冰箱中备用。

1.3 实验仪器 Morris水迷宫(安徽正华生物仪器设备有限公司)；跳台(北京中医药大学基础医学院实验室)；超声破碎仪(型号YD-6L，金华市益迪医疗设备有限公司)；转移脱色摇床(型号TS-8型，海门市其林贝尔公司)；电子天平(型号MP5002，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；微型电动匀浆器(型号AG285，美国Sigma公司)；紫外分光光度计(德国biophotometer)；高速离心机(型号YD-6L，德国biophotometer)；恒温水浴箱(型号TS-8型，海门市其林贝尔公司)；电泳仪(型号DYY-8C，北京市六一仪器厂)；垂直电泳槽(美国Bio-Rad)；稳压稳流电泳仪(美国Bio-Rad)；半干转电转印仪(美国Bio-Rad)。

1.4 分组、造模与给药

1.4.1 实验动物分组 按照手术70%死亡率和60%成模率计算，进购Wistar大鼠40只，1周适应性饲养后，采用Open-filed实验评分分为正常组6只、脑卒中模型组34只。

1.4.2 脑卒中模型制备 采用新式线栓法[3]制备缺血性脑卒中大鼠模型。称重大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥钠(5 mL/kg体质量)麻醉。切开大鼠颈部正中间的皮肤，暴露、分离并结扎大鼠颈外动脉分支，在距颈总动脉分叉0.8～1.0 cm的距离处用双重线结扎颈总动脉，阻断颈总动脉血流。在颈总动脉的近端处做一小开口，从开口轻轻地插入已经预先用聚赖氨酸处理的线栓(直径0.26 mm)。插入过程中稍有遇阻力时，表明线栓已阻塞了大脑中动脉主干的起始部，即停止插入。线栓插入后松开动脉夹，在颈总动脉线栓插入的近心端结扎，缝合手术伤口，2 h后拔出线栓行缺血再灌注。有动物死亡后再补充动物。

1.4.3 动物入选标准 于术后2 h后苏醒并出现对侧前肢蜷曲行走转圈或向对侧倾倒者纳入，无此体征或2 h后仍不清醒者弃去。

1.4.4 VD模型制备与筛选[4-5]脑卒中模型大鼠常规饲养28 d后进行Morris水迷宫试验，(实验组大鼠平均逃避潜伏期-正常组大鼠平均逃避潜伏期)/实验组大鼠平均逃避潜伏期>20%定为VD大鼠，进入实验。

1.4.5 给药方法 治疗组给予颐脑解郁方，以相当于成人剂量的7倍计算，配成419 mg/kg混悬液(即1剂配方颗粒加100 mL 蒸馏水)，10 mL/kg，每天1次，连续4周。空白组、模型组使用蒸馏水灌胃，10 mL/kg。灌胃量依据每周各组大鼠体质量变化调整。

1.5 Morris水迷宫测试 Morris水迷宫主要检测大鼠记忆分辨与学习能力，本实验采用隐蔽平台试验和空间探索试验，选取潜伏期、平台穿越次数作为模型筛选和评价标准。Morris水迷宫共进行5 d，1～4 d为定位航行实验，第5天为空间探索实验。每天测试开始时间固定，水迷宫试验在安静、恒温的暗室进行，室温(23±1)℃，水温(22±1)℃。水迷宫直径1.8 m，水深31 cm，水迷宫壁内呈黑色，分为4个象限，在其中一象限内1/3处有一个低于水面1 cm的平台，整个实验过程保持平台位置不变。定位航行实验共4 d，每只大鼠每天测试4次，每次随机选取1个象限将大鼠缓缓放入水中(头朝池壁)，每只动物每天每个象限只能测试1次。每只大鼠单次在象限自由游泳时间为60 s，当大鼠四肢完全爬上平台时停止计时，并记录所需时间，即逃避潜伏期，动物在平台上停留30 s再进行下一象限的训练。若大鼠在60 s内未找到隐藏在水面下的平台，则由实验者将大鼠引导至平台处，同样停留30 s后进行下一象限训练。第5天为空间探索实验，在定位航行实验24 h后撤除平台，将大鼠从原平台对侧象限放入，使其自由游泳60 s，记录逃避潜伏期(第一次找到平台时间)及平台穿越位置次数。在60 s内动物穿越原平台位置的次数越多、逃避潜伏期越短，说明其空间学习记忆能力越好。

1.6 跳台实验 该装置为15 cm×30 cm×30 cm的被动条件反射箱，箱子内的底面上覆盖了铜网格,周围区域是黑色的塑料板，内有高和直径均为4.5 cm橡胶台作为安全区。实验分两天进行，第1天为训练期，先将动物轻放在箱内橡胶台上适应3 min，然后再给铜网格通以40 V交流电，当动物受到电击后会出现跳上橡胶台的逃避反应。第2天为测试期，在同一时间给铜网格通电的情况下，直接将动物置于橡胶台上，记录大鼠第1次受到电击的时间(潜伏期)以及5 min受到电击(犯错误)次数。

1.7 P38-MAPK受体后信号分子测定 动物禁食水12 h后，1%戊巴比妥钠(5 mL/kg体质量)腹腔注射麻醉，在低温下快速分离大鼠右侧(病侧)皮质和海马体，记录重量后置于冻存管中，-80 ℃冰箱保存。用RIPA细胞裂解液提取目的蛋白，BCA法测定蛋白浓度，以30 μg总蛋白上样量进行10%和5%SDS-PAGE电泳，将电泳产物恒压转印至PVDF膜。转印完成后，用5%脱脂奶粉在室温下封闭1 h，分别加入兔抗大鼠P38-MAPK单克隆抗体(1∶2 000)，内参抗体(1∶2 000)，4 ℃孵育过夜。次日用TBST缓冲液摇洗3次，加入相应的二抗(1∶2 000)室温孵育1 h，然后用TBST 缓冲液摇洗3次；凝胶成像仪进行拍片；Quantity One软件对目的蛋白条带和内参条带的灰度值进行分析，按相对灰度值=目的蛋白的灰度值/内参蛋白灰度值，计算P38-MAPK蛋白相对表达值。

2 结 果

2.1 测试期Morris水迷宫结果 平台穿越次数结果显示：与正常组比较，模型组平台穿越次数明显减少，差异具有统计学意义(P<0.01)；经颐脑解郁方干预后，与模型组比较，治疗组平台穿越次数显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。逃避潜伏期结果显示：与正常组比较，模型组逃避潜伏期明显延长，差异具有统计学意义(P<0.01)；经颐脑解郁方干预后，与模型组比较，治疗组逃避潜伏期明显减小，差异具有统计学意义(P<0.01)。详见表1。

表1 各组Morris水迷宫测试结果(±s)

与正常组相比，①P<0.05，②P<0.01；与模型组相比，③P<0.05，④P<0.01。

2.2 跳台实验 犯错误次数结果显示：与正常组比较，模型组犯错误次数明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01)。经颐脑解郁方干预后，与模型组比较，治疗组犯错误次数显著减少，差异具有统计学意义(P<0.05)；潜伏期结果显示：与正常组比较，模型组潜伏期明显缩短，差异具有统计学意义(P<0.01)；经颐脑解郁方干预后，与模型组比较，治疗组潜伏期明显延长，差异具有统计学意义(P<0.01)。详见表2。

表2 各组跳台实验结果比较(±s)

与正常组相比，①P<0.05，②P<0.01；与模型组相比，③P<0.01。

2.3 P38-MAPK含量测定 大鼠右侧皮质(病侧)中，与正常组比较，模型组P38-MAPK的含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；经颐脑解郁方干预后，与模型组比较，治疗组P38-MAPK含量明显下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。在大鼠右侧(病侧)海马体中，与正常组比较，模型组大鼠P38-MAPK的含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；经颐脑解郁方干预后，与模型组比较，治疗组P38-MAPK含量明显下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。详见表3。

表3 各组大鼠右侧皮质和海马P38-MAPK含量比较(±s)

与正常组相比，①P<0.05，②P<0.01；与模型组相比，③P<0.01。

图1 各组大鼠皮质和海马P38-MAPK表达

3 讨 论

VD是指由各类脑部血管因素造成记忆、认知和行为等脑区低灌注的脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征，是脑卒中后常见疾病之一。本病的症状与中医学“呆病”“呆痴”“健忘”等相似[6]，其病变部位在脑，主要涉及肝、心、肾、脾，多以精气亏虚为发病之本，风、火、痰、瘀为致病之标。

在《华佗神医秘传》中对“痴呆”有了首次明确记载[7]，明代《景岳全书》[8]有云：“痴呆证，凡平素有痰，或以郁结，或以不遂，或以思虑，或以惊恐而渐至痴呆”，是首次将痴呆列为独立性疾病。《唐容川医学全书》[9]提出：“事物所以不忘，赖此记性，记在何处，则在肾经，益肾生精化为髓，而藏于脑。”揭示了肾精充足与否和记忆力息息相关。若肾精气亏虚，化髓乏源则脑无髓以充，髓减脑空又导致人善忘思滞、呆傻愚钝。

唐启盛教授根据多年临床治疗经验，同时结合“肾藏精起亟”“主骨生髓，上注于脑”的生理机能特点，认为肾气虚则精水空，水少则木不得涵，肝不得养则疏泄失常，气机不畅，因虚致实，气机失司则痰瘀浊毒阻滞脑络；反之，肝郁日久及肾，子盗母气，因实致虚，从而导致疾病迁延难愈。颐脑解郁方中以刺五加、郁金二药为君为臣，佐以五味子和栀子。刺五加甘温，郁金苦寒，两者配伍既可以益气补肾、填精益髓，又可以疏肝利胆，行气解郁，肾气足则脑髓渐充，肝气达则郁气自疏。栀子味苦性寒，行清泻火热疫毒之功，清解脑络痰浊瘀毒；五味子酸温，有涩精滋肾安神之力，又可以防止郁金、栀子苦寒清泻过度，敛正气而不敛邪气。P38-MAPK是MAPK家族的重要组成之一，在哺乳动物应激反应与炎症反应过程中起着关键作用。在脑内，P38-MAPK参与神经元细胞的存活、分化和发育过程，并被认为在促进神经元细胞炎症反应和凋亡途径中起主要作用，并且这两个功能与血管性痴呆的发病密切相关。因此，探究P38-MAPK在神经系统疾病中如何发挥调控作用已成为近年来的研究热点。

神经元细胞蛋白磷酸化和去磷酸化的平衡受到P38-MAPK的影响，P38-MAPK激活后使 Tau蛋白高度磷酸化和神经纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)的形成，最终导致血管性痴呆的发生[10]。P38-MAPK磷酸化水平与长时程增强(LTP)呈明显的负相关性。在动物实验中发现，当动物脑缺血再灌注时P38-MAPK不仅表达量大量增加，而且迅速磷酸化，从而进一步活化下游的转录因子，如MAPKAP -2、 MAPKAP -3及Caspase-3、 Caspase-6、Caspase-7等，导致细胞内与凋亡相关的基因大量表达，最终引起神经元细胞延迟性死亡的发生，影响海马神经突触的可塑性，导致 LTP损伤[11]。在运用P38-MAPK抑制剂SB202190后，可以明显降低大鼠脑内因P38-MAPK磷酸化水平升高而导致的氨基酸代谢紊乱，尤其是可以降低脑内甘氨酸以及 γ-氨基丁酸的含量[12]，保护大鼠海马区神经元，从而提高大鼠的学习记忆能力。张艳波等[13-14]也证实血管性痴呆会导致P38-MAPK磷酸化，注射小檗碱治疗血管性痴呆大鼠时，P38-MAPK的作用受到明显抑制，减缓炎症介质如MCP-1的释放，使局部炎症反应得到有效控制[15]，减轻炎症对神经元细胞的损伤，改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力。

本实验结果表明，与模型组相比，经中药干预后治疗组Morris水迷宫和跳台实验的指标均有一定程度的改善，说明经颐脑解郁方灌胃治疗后，大鼠的学习能力和认知功能得到了明显改善。Western-Blot的检测结果也表明，治疗组P38-MAPK蛋白含量也明显降低，与行为学结果相一致。推测颐脑解郁方可能是通过降低因脑卒中引起的P38-MAPKL磷酸化水平，减轻脑缺血引起的局部炎症反应，而且抑制了凋亡基因的表达，减少脑神经元死亡数量，间接起到保护神经元的作用，改善因脑卒中后引起的认知功能障碍，进而对血管性痴呆起到治疗效果。本研究初步验证了P38-MAPK可能是颐脑解郁方发挥作用的一个靶点，但具体机制仍需进一步的探讨和研究。