干扰TBL1XR1表达对口腔鳞癌细胞增殖和迁移的影响及其机制

王小芳，贾培增

1 商丘工学院医学院临床系，河南商丘476000；2 北京大学口腔医院

口腔鳞癌(OSCC)是头颈部常见的恶性肿瘤，占口腔颌面部恶性肿瘤总数的90%以上。在我国OSCC的发病率为3.6/10万～8.0/10万，近年来其发病率呈明显上升趋势[1～3]。OSCC早期即可发生颈部淋巴结转移，属于隐匿性微转移。有研究发现，约40%的早期OSCC患者存在隐匿性颈部淋巴结转移，这可能是患者病死率较高的重要原因之一[4]。OSCC传统治疗方法为手术切除、局部放疗、全身化疗等，虽然这些治疗手段在不断改进，但患者5年生存率依然无明显提高[5，6]。目前，OSCC发病的分子机制尚不完全清楚。因此，探索与OSCC发生、发展相关的分子，对其早期诊断、靶向治疗和预后监测具有重要意义。转导素β1X连锁受体蛋白1(TBL1XR1)是大多数组织中普遍存在的核蛋白，含F-box/WD40重复序列，在信号通路的调节过程中具有重要作用[7，8]。有研究发现，在非小细胞肺癌、宫颈癌、卵巢癌等恶性肿瘤组织中TBL1XR1表达失调，其异常表达能够影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等恶性生物学行为[9～11]。但干扰TBL1XR1表达能否抑制OSCC细胞增殖和迁移尚不清楚。为此，2017年1月～2018年12月，本研究观察了干扰TBL1XR1表达对OSCC细胞增殖和迁移的影响，并初步探讨其作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人OSCC细胞系Cal-27(以下称Cal-27细胞)，美国ATCC细胞库。TBL1XR1 shRNA、scramble shRNA，上海汉恒生物科技有限公司。所有引物设计由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。7500型荧光定量RCR仪，美国ABI公司；NanoDrop 2000超微量分光光度计、MK3型酶标仪，美国Thermo公司；Transwell小室，美国Coring公司；电泳仪，美国Bio-Rad公司。PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR®Premix EX TaqTMⅡ，日本TaKaRa公司。RIPA裂解液，上海贝博生物科技有限公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒，美国Thermo公司；JAK2与磷酸化JAK2(p-JAK2)、STAT3与磷酸化STAT3(p-STAT3)、GAPDH单克隆抗体及HRP标记的IgG二抗，英国Abcam公司。

1.2 细胞培养与转染 将Cal-27细胞接种于含10% FBS的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。每2天更换一次培养基。当细胞融合95%左右时，按1∶3传代。取传2代、对数生长期、生长状态良好的Cal-27细胞，按1×105个/孔铺于6孔板，随机分为无关序列组、TBL1XR1干扰组，每组设3个复孔。然后将6孔板置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养12 h，更换为无血清培养基，分别加入TBL1XR1 shRNA、scramble shRNA转染。转染12 h，更换为完全培养基继续转染。收集两组转染48 h细胞，采用TRIzol法提取细胞总RNA，经NanoDrop 2000超微量分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格，可用于后续实验。按PrimeScriptTMRT reagent Kit说明将总RNA逆转录为cDNA。逆转录条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 30 s。以cDNA为模板，按SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ说明进行PCR扩增。引物序列：TBL1XR1上游引物5′-CACCCGCTGCATTGATTTCTA-3′，下游引物5′-TACGGCATCTATCAGGGACAG-3′；内参β-actin上游引物5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′，下游引物5′-GCCGGACTCATCGTACTCC-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性5 s，95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s共40个循环。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 细胞增殖活性检测 采用MTS法。收集两组转染72 h细胞，以3×103个/孔接种于96孔板，每组设5个复孔。然后将96孔板置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。分别于培养24、48、72、96 h，每孔加入MTS 30 μL，37 ℃孵育2 h，采用MK3型酶标仪检测各孔490 nm波长处的光密度(OD)值。以OD490值代表细胞增殖活性。实验重复3次，取平均值。

1.4 细胞增殖能力检测 采用平板克隆形成实验。收集两组转染72 h细胞，以300个/孔接种于6孔板，每组设3个复孔。然后将96孔板置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。每3天更换一次培养基。直至肉眼可见克隆团形成时，弃掉培养基，甲醇固定10 min，结晶紫染色15 min，拍照观察，肉眼计数克隆形成数目。实验重复3次，取平均值。

1.5 细胞迁移能力检测 采用Transwell迁移实验。收集两组转染72 h细胞，用无血清细胞培养基重悬，调整细胞密度为1×106个/mL。将Transwell小室的上室加入细胞悬液100 μL，下室加入含500 μL完全培养基的24孔板，然后将Transwell小室置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。培养24 h，取出Transwell小室，用棉签轻轻拭去Transwell小室上室未穿膜细胞，甲醇固定10 min，结晶紫染色15 min，倒置显微镜下观察。随机选取5个100倍视野，计数穿膜细胞数。以穿膜细胞数代表细胞迁移能力。实验重复3次，取平均值。

1.6 JAK2/STAT3信号通路关键蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集两组转染72 h细胞，RIPA裂解液提取细胞总蛋白，经BCA蛋白浓度检测试剂盒鉴定，提取的细胞总蛋白浓度合格。然后加入5×上样缓冲液，煮沸变性。取变性蛋白50 μg，SDS-PAGE分离蛋白并将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上。取出PVDF膜，用5% BSA室温封闭1 h，分别加入JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、GAPDH单克隆抗体(稀释比均为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。次日，加入HRP标记的IgG二抗(稀释比1∶1 000)，室温孵育2 h。ECL发光、曝光、显影，Image J软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以GAPDH为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 两组TBL1XR1 mRNA表达比较 TBL1XR1干扰组与无关序列组TBL1XR1 mRNA相对表达量分别为0.21±0.06、1.00±0.05。TBL1XR1干扰组TBL1XR1 mRNA相对表达量低于无关序列组(t=30.53，P<0.05)。

2.2 两组细胞增殖活性比较 见表1。

表1 两组培养不同时间细胞增殖活性比较

注：与无关序列组比较，*P<0.05。

2.3 两组细胞增殖能力比较 TBL1XR1干扰组与无关序列组克隆形成数目分别为(41.25±10.36)、(89.33±15.06)个。TBL1XR1干扰组克隆形成数目低于无关序列组(t=18.74，P<0.05)。

2.4 两组细胞迁移能力比较 TBL1XR1干扰组与无关序列组穿膜细胞数分别为(63.29±14.03)、(104.58±17.52)个。TBL1XR1干扰组穿膜细胞数低于无关序列组(t=20.57，P<0.05)。

2.5 两组JAK2/STAT3信号通路关键蛋白表达比较 见表2。

3 讨论

据WHO预计，在未来十几年中OSCC的发病率将持续上升，已然成为一种威胁人类健康和严重影响患者生活质量的公共卫生问题之一。OSCC传统治疗方法为手术切除、局部放疗、全身化疗等，但由于OSCC早期即可发生隐匿性颈部淋巴结转移，导致传统治疗方法疗效较差，患者5年生存率低于50%[5，6]。因此，寻找新的治疗方法对改善OSCC患者预后具有重要意义。分子靶向治疗是近年来发展非常迅速的新型治疗方式，已用于EGFR突变的非小细胞肺癌和ErbB2阳性的乳腺癌，并呈现出良好的治疗效果。但目前临床缺乏OSCC治疗有效的药物靶点，而这些有效的药物靶点是肿瘤发生、发展过程中的关键分子。因此，从分子水平上探索OSCC的发病机制，是寻找OSCC药物靶点的关键。

表2 两组JAK2/STAT3信号通路关键蛋白相对表达量比较

注：与无关序列组比较，*P<0.05。

TBL1XR1基因定位于人染色体3q26.32，由18个外显子组成，长度为178 119 bp。TBL1XR1是维甲酸和甲状腺激素受体复合物的沉默介质，也是核受体辅阻遏物的核心成分，可调控各种转录因子的转录活性[7，8]。有研究报道，TBL1XR1在非小细胞肺癌、骨肉瘤和浆液性上皮性卵巢癌等组织中表达上调，其表达上调与肿瘤恶性进展和患者预后不良密切相关[9～12]。Liu等[13]研究认为，TBL1XR1是肿瘤分子靶向治疗潜在的靶标。但目前TBL1XR1在OSCC发病机制中的作用尚不清楚。在人类癌症数据库TCGA中，头颈部鳞癌(HNSCC)组织TBL1XR1表达明显高于正常组织，这些HNSCC组织起源于口腔、喉、咽等鳞状上皮，占全身恶性肿瘤的4.7%～20.3%[3]。而OSCC的发病率在HNSCC中居第二位[14]。由此推测，TBL1XR1在OSCC组织中表达升高。有研究发现，TBL1XR1在多种恶性肿瘤组织中高表达，其高表达与肿瘤恶性进展和患者预后不良有关。Zhang等[9]采用CRISPR-Cas9技术敲除非小细胞肺癌A549细胞中TBL1XR1表达发现，肿瘤细胞存活、增殖和迁移能力均明显降低；干扰TBL1XR1表达，无论是在体外还是在体内均能降低骨肉瘤干细胞样表型和肿瘤细胞的致瘤性[12]；沉默TBL1XR1表达能够抑制浆液性上皮性卵巢癌细胞的增殖和侵袭能力[15]。结果提示，TBL1XR1与多种肿瘤细胞的增殖、迁移等恶性生物学行为有关。本研究采用瞬时转染技术干扰Cal-27细胞TBL1XR1表达，经RT-qPCR验证，TBL1XR1干扰组TBL1XR1 mRNA相对表达量低于无关序列组，表明该技术能够下调Cal-27细胞中TBL1XR1表达，可用于后续实验。进一步研究发现，TBL1XR1干扰组细胞增殖活性、细胞增殖和迁移能力均低于无关序列组。提示TBL1XR1能够参与OSCC细胞的恶性生物学行为，但其具体的分子机制仍不清楚。

在非小细胞肺癌中，TBL1XR1能够通过主调节因子c-Met调节细胞外调节激酶和蛋白激酶B信号途径，参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁转以及化疗耐药[9]。在浆液性上皮性卵巢癌中，沉默TBL1XR1表达能够通过下调血管内皮生长因子C，抑制肿瘤细胞的迁移能力[15]。而Zhou等[16]研究报道，TBL1XR1可能通过激活β-catenin/MMP-7/EGFR/ERK信号通路，促进胃癌的发生、发展。由此可见，TBL1XR1在不同恶性肿瘤中的作用途径并不一致，可能存在多种调控信号通路。JAK2/STAT3信号通路是调控肿瘤细胞恶性增殖、侵袭和迁移的重要信号通路之一[17]。在正常条件下，JAK2/STAT3信号通路的激活受到严格调控，JAK2和STAT3激活的时间较短，但能促进机体生长发育。在病理条件下，JAK2/STAT3信号通路受到持续性刺激，JAK2和STAT3激活的时间延长，JAK2和STAT3发生磷酸化，磷酸化的JAK2和STAT3能够进入细胞核，调控下游靶基因，导致细胞恶性转化[18]。有研究发现，JAK2/STAT3信号通路在OSCC细胞中处于异常活化状态[19，20]。但干扰TBL1XR1表达抑制OSCC细胞增殖和迁移是否与JAK2/STAT3信号通路异常活化有关尚不清楚。本研究结果发现，TBL1XR1干扰组JAK2/STAT3信号通路关键蛋白p-JAK2、p-STAT3相对表达量均低于无关序列组，而两组JAK2、STAT3蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义，与Xi等[12]报道基本一致。提示JAK2/STAT3信号通路异常激活可能是TBL1XR1促进OSCC细胞增殖和迁移能力的重要途径之一。

综上所述，干扰TBL1XR1表达能够抑制OSCC细胞增殖和迁移能力，其作用可能是通过调控JAK2/STAT3信号通路关键蛋白实现的。TBL1XR1有可能成为治疗OSCC的分子靶标。