儿茶酚和莨菪碱对水稻纹枯病菌氨基酸合成和分泌的影响

江绍锋，赵 美，舒灿伟，周而勋*

（1.华南农业大学 农学院/广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室，广东 广州 510642；2.桂林医学院 基础医学院，广西 桂林 541000）

【研究意义】水稻纹枯病是由立枯丝核菌（Rhizoctonia solaniKühn）引起的水稻三大真菌病害之一，它是一种重要的土壤传播的植物病原真菌病害。黑色素是植物病原真菌重要的毒力因子。生物体内氨基酸是黑色素形成的主要前体物质，不仅与形成的黑色素类型和色素沉淀深浅密切相关，同时也影响到生物的健康状况。氨基酸在水稻纹枯病菌黑色素形成中起着重要的作用，对水稻纹枯病菌防治具有潜在价值。【前人研究进展】氨基酸不仅是生物合成蛋白质的重要原料，也是生物进行正常生长，维持生命的重要物质组成基础，生物调节自身新陈代谢的关键就是通过氨基酸相关代谢途径合理的转化和转换[1]。某些氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸等）在相应的氧化还原酶催化下发生棕色化反应，形成对生物具有重要新陈代谢影响的吡嗪、吡咯和呋喃类化合物[2-4]。苯丙氨酸在苯丙氨酸羟化酶（phenylalamine hyolroxylase）的催化作用下引入羟基，由叶酸还原酶催化生成二氢生物喋呤，再通过辅酶（四氢生物嘌呤），在NADPH和H+存在的条件下还原为四氢化合物，苯丙氨酸羟化酶的催化反应是不可逆的，不能够由体内酪氨酸转变为苯丙氨酸[5]。酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下羟化合成多巴，然后多巴再经氧化作用形成多巴醌，多巴醌进一步通过环化和脱羧作用生成吲哚醌，最终进入合成黑色素的代谢途径。人和小鼠等动物若缺乏酪氨酸酶，体内黑色素合成代谢发生障碍，就会使皮肤、毛发变“白”，出现白化病（albinism）[6-10]。酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase）催化酪氨酸成为3，4-二羟基苯丙氨酸，又称为多巴（3，4-dihydroxyphenylalanineL，DOPA）。酪氨酸羟化酶也是通过以四氢生物喋呤为辅酶的单加氧酶，然后多巴在多巴脱羧酶的作用下催化生成多巴胺（dopamine）；多巴胺需要在多巴胺-β-氧化酶（dopamine-β-oxidase）的催化下使β-碳原子羟化，得到去甲肾上腺素（norepinephrine）；最终通过去甲肾上腺素甲基化合成肾上腺素（epinephrine）[11]。以上的多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素三者统称为儿茶酚胺（catecholamine）[12]。在黑色素细胞中，酪氨酸羟化酶是儿茶酚胺合成最重要的限速酶，同时会受到终产物的反馈调控。【本研究切入点】水稻纹枯病菌过氧化氢酶（RsCat）受到儿茶酚的负调控，随着外源儿茶酚质量浓度的升高，酶活力降低[13]；而儿茶酚是水稻纹枯病菌苯酚2-单加氧酶（RsPhm）催化的底物，在菌核和黑色素形成中起着重要的作用[14]。Abdelmotaal等[15]研究表明莨菪碱会引起稻瘟病菌和立枯丝核菌菌丝体电解质的泄露，进而抑制孢子萌发和附着胞的形成，400 μg/mL质量浓度的莨菪碱使稻瘟病菌附着胞死亡率约为10%，而当莨菪碱浓度为1 000 μg/mL时，附着胞死亡率高达70%。儿茶酚是一种抗氧化剂，有抗衰老和抗真菌的效果。实验前期研究发现在马铃薯琼脂培养基添加300 μg/mL质量浓度的莨菪碱促进纹枯病菌菌丝和菌核的生长，而50 μg/mL质量浓度的儿茶酚抑制纹枯病菌菌丝和菌核生长，这两种物质对水稻纹枯病菌菌丝和菌核表型的影响明显，是非常好的黑白表型对照[16]。【拟解决的关键问题】本研究通过比较水稻纹枯病菌菌丝体和发酵液中的游离氨基酸含量和组成的差异，筛选可能与水稻纹枯病菌黑色素存在密切关联的氨基酸，为进一步揭示氨基酸在水稻纹枯病菌黑色素形成中的作用提供参考，对未来防治水稻纹枯病具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 菌株信息和培养基

水稻纹枯病菌（R.solaniAG1-IA）GD-118来源于本实验室保存的强致病力菌株[17]。

马铃薯琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）：葡萄糖20.0 g，马铃薯200.0 g，双蒸水1 000.0 mL，琼脂粉18.0 g；马铃薯液体培养基（potato dextrose broth，PDB）：葡萄糖20.0 g，马铃薯200.0 g，双蒸水1 000.0 mL。用高压蒸汽灭菌锅在121℃、105 MPa条件下灭菌20 min。

1.2 主要仪器和试剂

氨基酸分析仪（日立L-8800型），氨基酸标准品。

1.3 水稻纹枯病菌培养

从斜面平板上挑取水稻纹枯病菌（R.solaniAG1-IA）GD-118菌株在PDA培养基28℃培养2 d。

1.4 水稻纹枯病菌样品的收集

利用打孔器（直径5.0 mm）在生长2 d菌龄的水稻纹枯病菌GD-118菌株的菌落边沿对PDA培养基打孔，用灭菌的牙签挑取菌丝块，然后把10个菌丝块转移到含有终浓度为50 μg/mL质量浓度的儿茶酚组（RsC），300 μg/mL质量浓度的莨菪碱组（RsH）的150 mL PDB培养基的三角瓶中，对照组（Rs）不做任何处理（空白PDB）。接菌后，将3种处理的培养基置于摇床，28℃恒温振荡培养3 d后，用抽气泵过滤，分别收集菌丝体和发酵液样品，称量菌丝体的重量，然后用无菌水洗涤菌丝体2～3次，最后再用灭菌滤纸吸干菌丝体样品表面多余的水分，菌丝体和发酵液样品分别用于下一步的氨基酸分析。

1.5 样品的前处理

将样品分别定量后放入水解管中，往菌丝体的水解管中分别加入6 mol/L 10 mL盐酸，5 mL发酵液的水解管中分别加入5 mL浓盐酸（12 mol/L），然后接在真空泵抽气管上，使水解管减压后封口，再把封好的水解管放入恒温干燥箱（110±1）℃进行水解22 h后，拿出冷却。打开水解管，过滤，取出1 mL滤液，置于浓缩器中干燥，残留物用1 mL去离子水溶解后蒸干，如此重复3次，再加入1 mL缓冲溶液（pH 2.2）混合溶解，最终由氨基酸自动分析仪进行测定。

1.6 氨基酸的定性和定量分析

根据GB/T18246—2000《饲料中氨基酸的测定》标准中的测定方法进行检测。氨基酸的定性应用氨基酸标准品的保留时间进行检测。氨基酸定量利用建立外标法的标准曲线来定量分析。氨基酸混标液浓度为50 μmol/L，进样量为20 μL，重复3次，然后再按照每个氨基酸浓度和峰面积绘制氨基酸标准曲线，最终利用建立的标准曲线对样品中氨基酸的含量进行定量。在相同的色谱条件下对水稻纹枯病菌菌丝体和发酵液样品进行定量分析。

1.7 检测条件

柱温：程序恒温57℃；色谱柱：日立855-350型；反应柱温：135℃；柠檬酸（钠）pH缓冲液梯度洗脱；检测波长：570 nm，440 nm；流速：洗脱泵0.40 mL/min，衍生泵0.35 mL/min；分析时间：59 min。

1.8 数据统计与分析

所得数据利用SPSS Statistics 19.0软件采用方差分析（ANOVA），采用LSD多重分析进行统计检验，所有数据都在5%的水平上进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 水稻纹枯病菌菌丝体重量的分析

水稻纹枯病菌在28℃摇床振荡培养3 d后，对照组的水稻纹枯病菌菌丝体重量与50 μg/mL质量浓度的儿茶酚处理组没有显著差异，但与300 μg/mL质量浓度的莨菪碱处理组有极显著差异（图1）。

2.2 标准曲线及标准氨基酸含量

通过氨基酸自动分析仪分析17种氨基酸标准液色谱结果如图2所示。从图2可以看出，标准液中各个氨基酸组分都有很好的分离。图2A是用于检测除Pro（脯氨酸）以外的其它16种氨基酸，吸收峰为570 nm，图2B用于检测Pro，吸收峰为440 nm。

通过氨基酸混标液进行分析，以氨基酸标准品质量浓度为横坐标，根据每个氨基酸出峰时间来判断氨基酸种类，以峰面积为标准氨基酸标准品的质量浓度，建立17种氨基酸的标准曲线，分析结果如表1所示。

图1 水稻纹枯病菌在不同培养条件下菌丝体重量的比较Fig.1 Comparison of mycelial weight of R.solani AG-1 IA under different cultural conditions

图2 标准氨基酸色谱Fig.2 Chromatogram of standard amino acids

2.3 菌丝体氨基酸含量与组成差异分析

水稻纹枯病菌菌丝体氨基酸含量与组成差异分析见表2。由表2可以看出，影响黑色素形成的前体物质苯丙氨酸，在对照组和50 μg/mL质量浓度的儿茶酚处理组中没有显著差异，但是在300 μg/mL质量浓度的莨菪碱处理组中与对照组和儿茶酚处理组中都存在显著差异，并且莨菪碱处理组的总氨基酸含量与对照组和儿茶酚处理组也存在显著差异。而另一个影响黑色素形成的前体物质酪氨酸，3种处理（组别）间的差异不显著。同时也发现天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸和精氨酸共10种氨基酸在儿茶酚处理组和莨菪碱处理组存在显著差异。在3种处理中，水稻纹枯病菌菌丝体天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸3种氨基酸含量相对比较丰富，分别达到了总氨基酸的9.44%，15.49%和9.61%，而甲硫氨酸占总氨基酸的含量最低，只有1.44%。

表2 水稻纹枯病菌菌丝体氨基酸组成分析Tab.2 Analysis of the amino acid composition of mycelia of R.solani AG-1 IA

2.4 发酵液氨基酸含量与组成差异分析

水稻纹枯病菌发酵液氨基酸含量与组成差异分析见表3。影响黑色素形成的前体物质酪氨酸在对照组和50 μg/mL质量浓度的儿茶酚处理组没有显著差异，但是300 μg/mL质量浓度的莨菪碱处理组与对照组和儿茶酚处理组都存在显著差异，另一种黑色素的前体物质苯丙氨酸在3个组别间的差异不显著，同时水稻纹枯病菌发酵液中其它11种氨基酸（赖氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸、脯氨酸）也不存在显著差异。在水稻纹枯病菌发酵液游离的氨基酸天冬氨酸和谷氨酸含量相对远远高于其它氨基酸含量，分别达到了总氨基酸的17.83%和58.21%，而苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸含量相对较低，不到总氨基酸的1%。水稻纹枯病菌发酵液中总氨基酸含量不存在显著差异。

表3 水稻纹枯病菌发酵液氨基酸组成分析Tab.3 Analysis of amino acid composition in the fermentation broth of R.solani AG-1 IA

3 结论与讨论

黑色素是植物病原真菌至关重要的毒力因子，而氨基酸是病原真菌黑色素形成的主要前体物质，它不仅影响着黑色素的形成，同时也影响了生物的健康。Chen等[18]研究发现儿茶酚可以促进水稻纹枯病菌细胞壁的黑色素合成，进而有助于水稻纹枯病菌侵染水稻组织。Jiang等[10]研究表明儿茶酚可以促进水稻纹枯病菌黑化，同时也增强了水稻纹枯病菌对水稻的致病力。

通过对经2种化学药剂（莨菪碱和儿茶酚）处理后的水稻纹枯病菌的菌丝体和发酵液进行氨基酸含量和组成差异分析，结果发现菌丝体和发酵液游离的氨基酸含量差异有很大的不同，发酵液的游离氨基酸含量远远比水稻纹枯病菌菌丝体的氨基酸含量丰富。水稻纹枯病菌发酵液中各游离的氨基酸（天冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸）含量存在不同程度的差异，而丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸等的差异相对较小。不管是水稻纹枯病菌菌丝体，还是发酵液，一般来说对于同一种氨基酸，对照组和处理组之间同一种氨基酸含量比其它氨基酸含量的一致性高。在培养基上添加含硫氨基酸，如组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或酪氨酸等，水稻纹枯病菌会减少甚至不形成菌核[19]。

在水稻纹枯病菌菌丝体中天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸3种氨基酸含量相对比较丰富，分别达到了总氨基酸的9.44%，15.49%和9.61%，其中谷氨酸的含量最高，这与毕韵梅等[20]的研究结果一致。而水稻纹枯病菌发酵液中天冬氨酸和谷氨酸含量分别占到总氨基酸含量的17.83%和58.21%，结果表明不管是水稻纹枯病菌菌丝体还是发酵液都是谷氨酸和天冬氨酸最为丰富。谷氨酸作为生物体含量最大的一种氨基酸，小麦中的蛋白质中谷氨酸含量为30%～35%，饮食中95%的谷氨酸是由肠道细胞代谢[21]。在果蝇中发现胞外的谷氨酸通过受体脱敏过程调节突触谷氨酸受体，同时在伏隔核刺激代谢性的谷氨酸受体，进而减少细胞外谷氨酸水平，这说明细胞外的谷氨酸水平在生物体新陈代谢平衡系统中起着“内分泌”的作用[22-23]。

莨菪碱是一种生物碱。在300 μg/mL质量浓度的莨菪碱处理组中，影响水稻纹枯病菌菌丝体黑色素形成的前体物质苯丙氨酸跟对照组和儿茶酚处理组都存在显著差异，对照组和50 μg/mL质量浓度儿茶酚处理组没有显著差异，而前体物质酪氨酸在三者菌丝体比较中没有显著差异，可能的原因是苯丙氨酸羟化酶的催化反应是不可逆，体内的苯丙氨酸可以转变为酪氨酸，但是体内酪氨酸不能够转变为苯丙氨酸。水稻纹枯病菌发酵液中对照组和50 μg/mL质量浓度的儿茶酚处理组酪氨酸含量没有显著差异，但是300 μg/mL质量浓度的莨菪碱处理组跟对照组和儿茶酚处理组酪氨酸含量都存在显著差异，而苯丙氨酸在发酵液中不存在显著差异。综上，研究发现影响水稻纹枯病菌菌丝体和发酵液黑色素形成的氨基酸不同，在菌丝体中苯丙氨酸对黑色素形成更加重要，而在发酵液中，则是酪氨酸对黑色素形成更为关键，造成这些氨基酸差异的原因有待进一步研究和探讨，这为后续防治水稻纹枯病设计农药靶点提供了基础数据。