聚裂丛柳珊瑚和华丽肉芝软珊瑚共附生真菌的分离鉴定及抗氧化活性研究

沈恬安，张春晖，骆焱平，王兰英

（海南大学 植物保护学院，海南 海口 570228）

【研究意义】聚裂丛柳珊瑚（Rumphella aggregata）和华丽肉芝软珊瑚（Sarcophyton elegans）分别属刺胞动物门（Cnidaria），珊瑚虫纲（Anthozoa）的柳珊瑚目（Gorgonacea）和软珊瑚目（Alcyonacea）[1-2]。有报道指出，这两类珊瑚富含结构新颖、活性多样的代谢产物，是当今海洋药物开发重要的生物资源[3-5]。【前人研究进展】陈艳丽[7]发现，从柳珊瑚发酵液中提取的一种孢外多糖类物质具有很强的抗氧化活性。在生物细胞进行正常新陈代谢的过程中会产生造成机体损伤的自由基，这是引起细胞衰老的重要因素[6]，而抗氧化物质可以通过消除自由基延缓细胞衰老[7]。【本研究切入点】众多对珊瑚抗氧化活性研究表明，珊瑚是新型抗氧化活性物质重要来源。除此外，珊瑚共附生真菌也能够产生和寄主珊瑚相同或者相似酚酸类、生物碱、聚酮、黄酮、萜类等化合物，这些化合物均具有很好的抗氧化活性[8]，但目前报道中未见关于聚裂丛柳珊瑚和华丽肉芝软珊瑚共附生真菌方面的研究。【拟解决的关键问题】本研究拟从这两种珊瑚中分离共附生真菌，并对获得菌株发酵液测定高价铁离子的还原作用、DPPH自由基的清除能力、总酚和总黄酮的含量、ABTS自由基的清除能力、羟基自由基的清除能力，旨在发现具有潜在研究价值的菌株，为寻找新型抗氧化活性化合物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试珊瑚 聚裂丛柳珊瑚（R.aggregata）和华丽肉芝软珊瑚（S.elegans）采于海南省西沙群岛附近海域。

1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，海水1 L。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，海水1 L。MS培养基：麦芽提取物30.0 g，蛋白胨3 g，琼脂12 g，海水1 L。

1.2 实验方法

1.2.1 珊瑚样品处理及菌株分离 用清水洗净珊瑚表面，切下5 g珊瑚并将其切成小块。取无菌海水反复冲洗干净后放入灭菌的研钵中，用研杵将珊瑚碎片研磨至匀浆状，加入20 mL无菌海水配成样品液。取其上清液加入灭菌海水依次稀释至10-2，10-3，10-4，10-5g/mL，各吸取100 μL样品液均匀涂抹于平板上，20℃培养5 d。待平板上发现可挑取的无污染的菌落时，挑取真菌菌落的菌丝接种到另一PDA培养基上，20℃培养5 d。

1.2.2 共附生真菌发酵液的制备 将已分离纯化菌株接种到PDA培养基上，待菌株长到培养皿面积的2/3时，在PDA平板中加入3 mL灭菌海水，用灭菌涂布棒刮取真菌孢子，收集孢子悬浮液用无菌纱布过滤除去菌丝，在显微镜下利用血球计数板计数，然后用灭菌海水稀释孢子悬浮液至10-7CFU/mL。移取孢子悬浮液1 mL至100 mL马铃薯葡萄糖液体培养液（PDB）中，20℃、180 r/min恒温振荡培养3～5 d，获得菌株发酵液。将发酵液室温下5 000 r/min离心15 min，取上清液作为待测液，备用。

1.3 共附生真菌抗氧化活性测定

1.3.1 总酚含量 总酚含量测定实验步骤参照Hou等[9]方法并稍作修改。将1 mL样品液和0.5 mL Folin-Ciocalteu溶液中添加到5 mL ddH2O中，室温孵育5 min。然后加入1 mL Na2CO3溶液（5%w/v），黑暗中室温孵育60 min。用紫外分光光度法在760 nm处测定上述混合物的吸光度。以没食子酸试剂代替样品制作标准曲线。

1.3.2 总黄酮含量 总黄酮含量测定实验步骤参照Li等[10]方法并稍作修改。0.5 mL样品液加入至0.1 mL AlCl3（0.1 g/mL），0.1 mL CH3CO2K（1 mol/L）及4.3 mL ddH2O，混匀，孵育30 min。在450 nm处测定溶液的吸光度。以芦丁试剂代替样品制做标准曲线。

1.3.3 高价铁离子还原作用 高价铁离子还原作用测定参照Du等[11]的方法并稍做修改。将FeSO4配制成不同浓度梯度的溶液，以亚铁离子浓度（mol/L）为纵坐标（y），以波长593 nm吸光度作为横坐标（x），绘制硫酸亚铁标准曲线。配制铁离子还原溶液（FRAP）溶液，取0.1 mL待测液与3.0 mL FRAP溶液混合，37℃恒温水浴5 min，取出后迅速混匀，测量吸光度，通过硫酸亚铁标准曲线计算出混合液中硫酸亚铁浓度，评价供试菌株对高价铁离子还原能力。

1.3.4 DPPH自由基清除作用 对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH自由基）清除作用测定参照Liu等[12]的方法并稍做修改。在517 nm测吸光度Ai，用蒸馏水代替DPPH测定吸光度Aj，用蒸馏水代替样品测定吸光度A0。每个样品测定3次取平均值。DPPH清除率计算公式如下：

1.3.5 ABTS自由基清除作用 ABTS自由基清除作用测定参照Thoo等[13]的方法稍做修改：配制2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS自由基）溶液，取0.1 mL待测提取液加入3.9 mL ABTS自由基溶液，反应6 min混合均匀后在734 nm波长处测量吸光度Ai，用蒸馏水代替ABTS测量吸光度Aj，用蒸馏水代替样品测量吸光度A0。每个样品测定三次取平均值。ABTS的清除率计算公式如下：

1.3.6 羟基自由基清除作用 羟基自由基清除作用测定参照朱淑云等[14]的方法并稍做修改：在510 nm波长处测其吸光度记为Ai，用去离子水代替水杨酸的吸光度记为Aj，用去离子水代替样品的吸光度记为A0。每个样品测定3次，取平均值。

1.4 共附生真菌鉴定

1.4.1 真菌形态学鉴定 将菌种孢子悬浮液涂布于PDA平板上，使用插片法观察菌丝及孢子形态。

1.4.2 真菌的分子生物学鉴定 采用CTAB法提取真菌基因组DNA，并将提取获得的DNA通过引物ITS1与ITS4进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μL，其中Template（基因组DNA 20～50 ng/μL）：2 μL，Taq（mix）：12.5 μL，F1（ITS1）：1 μL，R1（ITS4）：1 μL，超纯水ddH2O：8.5 μL。扩增反应条件为：95 ℃预变性4 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共32个循环；72℃最后延伸7 min。送至深圳华大基因公司测序。利用NCBI中BLAST进行同源性比对，选出与该序列相似性较高的核酸序列。使用Mega 7.0采用邻接法（neighbor joining method）构建系统发育树，并通过自举数据集为1 000次的自举分析（bootstrap）进行置信度检测。

2 结果与分析

2.1 共附生真菌的分离纯化

从聚裂丛柳珊瑚中分离纯化得到6株真菌，从华丽肉芝软珊瑚分离纯化得到7株真菌，共13株真菌。其中8株从PDA培养基中分离得到，5株从MS培养基中分离得到（表1）。

表1 珊瑚共附生真菌的分离Tab.1 Isolation of coral symbiotic fungi

2.2 共附生真菌的抗氧化活性测定

2.2.1 总酚含量测定 拟合没食子酸的回归方程为y=0.001x+0.015 2，R2为0.997 1，说明方程相关性好，可信度高。通过回归方程计算各菌株发酵液中总酚含量作图（图1）可知，菌株S140和Z5的总酚含量最高，其中Z5达到了976.8 mg GAE/gDW，其他菌株的总酚含量相对较低。

图1 总酚含量的测定Fig.1 Determination of total phenol content

2.2.2 总黄酮含量测定 拟合芦丁的回归方程为y=0.001x+0.000 5，R2为0.999 1，可见方程相关性好，可信度高。通过回归方程计算各菌株发酵液中总黄酮含量作图可知（图2），Z5、Z9这五株菌的总黄酮含量较高，都达到了500 mg RE/gDW以上，尤其Z9可达809.5 mg RE/gDW。

图2 总黄酮含量的测定Fig.2 Determination of total flavonoids content

2.2.3 高价铁离子还原能力 由实验数据得到FeSO4的标准曲线y=0.007x+0.008 1，R2为0.998 1，可见方程相关性好，可信度高。通过标准曲线计算各菌株发酵液还原高价铁后亚铁离子含量（图3）可知，Z1、S3、S9、S134、S136这5株菌的高价铁离子的还原能力较高，在0.05水平上与其他菌株有显著性差异，其中S9号菌株的高价铁离子的还原能力最强，亚铁离子含量可达130.56 mmol/L Fe2+/g DW。

图3 高价铁离子还原能力的测定Fig.3 Determination of ferric-reducing antioxidant ability

2.2.4 ABTS清除率 测定获得菌株对ABTS清除作用，结果（图4）发现，菌株Z1、S9、S31对ABTS均有较好的清除作用，与其他菌株相比有显著性差异，其中菌株Z1的清除率最高，为75.90%；相比较而言，菌株S134的清除率相对较低。

图4 ABTS清除率的测定Fig.4 Determination of ABTS-scavening rate

2.2.5 DPPH清除率的测定 测定获得菌株对DPPH清除作用发现，多数共附生真菌发酵液对DPPH均有良好的清除作用，Z1、S9及S134的清除率较高，尤其Z1清除率可达78%；相比之下，菌株Z6的清除作用相对较差，清除率不足20%（图5）。

图5 DPPH清除率的测定Fig.5 Determination of DPPH-scavening rate

2.2.6 羟基自由基清除率的测定 测定获得菌株对羟基自由基清除作用，结果（图6）发现，菌株Z1、Z5的清除率较高，尤其Z1的羟基自由基清除率可达73.36%；相比较而言，Z6的羟基自由基清除率相对较低，为16.79%。

图6 羟自由基清除率的测定Fig.6 Determination of hydroxyl radical-scavening rate

2.3 共附生真菌形态学鉴定结果

对菌株Z1培养发现，该菌株菌落正面呈黑暗色，中心凸起，放射性沟纹，背面中央为黄色，有扩展轮纹，最外缘褐色；分生孢子呈球形（图7）。

图7 菌株Z1的菌落特征和微观形态观察Fig.7 Morphological observations of colonies and conidia of isolate Z1

对菌株S9培养发现，该菌株菌落圆形，有皱褶，正面白色，外缘为淡黄色，菌落背面呈浅橙色，有扩展轮纹；分生孢子椭圆形（图8）。

图8 菌株S9的菌落特征和微观形态观察Fig.8 Morphological observations of colonies and conidia of isolate S9

2.4 系统发育树

测得菌株Z1的ITS rDNA序列长度为557 bp，将此序列在GenBank中注册，获得注册号为MN217109，运用NCBI database中在线Blast比对发现，菌株Z1与枝孢属（Aspergillussp.）的真菌序列同源性较高。利用MEGA（Ver.7.0）软件构建基于rDNA-ITS序列的系统发育树（图9），菌株Z1与黑曲霉菌Aspergillus niger（JN688868.1）的进化距离最近。结合该菌株菌落特征及分生孢子形态特征，将菌株Z1初步鉴定为Aspergillus niger；测得菌株S9的ITS rDNA序列长度为592 bp，将此序列在GenBank中注册，获得注册号为MN217110，运用同样方法比对发现（图10），菌株Z1与Paraconiothyrium brasiliense（JQ936270.1）的进化距离最近。结合该菌株菌落特征及分生孢子形态特征，初步将菌株S9鉴定为P.brasiliens。

图9 菌株Z1基于ITS序列的系统发育树Fig.9 Phylogenetic tree of Z1 strain

图10 菌株S9基于ITS序列的系统发育树Fig.10 Phylogenetic tree of S9 strain

3 结论与讨论

本研究采用组织研磨法从供试的聚裂丛柳珊瑚和华丽肉芝软珊瑚中分离出13株共附生真菌。并对获得菌株进行抗氧化活性研究，综合所测定的指标发现，菌株Z1和S9抗氧化活性较为突出，依据菌株表观形态及ITS序列将Z1菌株初步鉴定为黑曲霉菌A.niger，S9菌株初步鉴定为P.brasiliense。

众所周知，在生物生长过程中，过量的自由基会给生物机体带来脂质过氧化，膜损伤以及DNA链断裂等多种危害，而抗氧化物质可以通过消除自由基使得生物机体免受损伤[15]。人们从海洋生物中寻找抗氧化物质是当今开发抗氧化药物较为有效的途径之一，如唐孝礼等[16]发现分离自海绵中的化合物aldisin能显著抑制脂质过氧化，有效地清除羟基自由基；魏玉西等[17]证实侧扁软柳珊瑚的提取物对羟自由基的清除效果优于商品抗氧化剂BTH及TBHQ。本研究所得共附生真菌均具有不同程度的抗氧化能力，尤其菌株Z1的发酵液对自由基清除率可达73.36%，优于上述魏玉西报道的扁软柳珊瑚提取物（66.36%）。另外，本研究发现，所获得的菌株除Z1和S9抗氧化活性较高外，其他菌株也有个别抗氧化活性指标较为突出，如Z5、Z9总黄酮含量都达到了500 mg RE/gDW以上，尤其Z9可达809.5 mg RE/gDW。因此，鉴于菌株抗氧化优势不同，在后续研究中可以有针对性的选择菌株进行开发利用。

人们普遍的认为，海洋共附生真菌产生的次生代谢产物具有种类丰富，结构新颖，活性高等特点[18-19]，本研究发现抗氧化活性较高的共附生真菌Z1和S9分别为黑曲霉菌和P.brasiliense。两类微生物在抗氧化活性方面报道较少，其中黑曲霉菌是曲霉属真菌中的常见的种，广泛分布于自然界中，关于其应用研究主要集中于食品发酵行业[20]，仅姚嘉晓等[21]报道了海绵共附生黑曲霉菌抗氧化活性，未见P.brasiliense相关研究。因此，为进一步明确菌株Z1和S9的开发应用价值，有必要对这两株菌发酵液抗氧化物质进行分离鉴定。