急性髓细胞白血病患儿miR-126表达水平与预后的关系研究

容蓉 班奕 周肖滢 王潇娉 王小明

急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）为一种异质性较强的血液系统恶性肿瘤，患者细胞对骨髓的侵袭抑制了红系和巨核系造血祖细胞的增殖，出现贫血及血小板减少。因白血病（acute leukemia，AL）原始细胞形态学相似，单一骨髓细胞显微镜检查诊断率约为80%，无法早期筛查及判断预后，因此明确其发病机制是关键[1]。microRNA（miRNA，简称miR）参与细胞增殖、分化、凋亡、生长发育及肿瘤发生等众多生物学过程，研究表明miRNA可通过调控耐药相关基因或抑癌基因表达，而在肿瘤细胞化疗敏感性方面发挥重要作用，早期有学者指出miR-181a在急性淋巴细胞白血病患儿、miRNA-125b在急性白血病中发挥作用[2-3]。而miR-126也是miRNA家族中的一员，研究显示脐静脉内皮细胞来源的颗粒携带miRNA-126可促进单核细胞迁移，微颗粒作为载体可携带miRNAs介导细胞间信号传递，但miRNA-126在儿童AML中的表达水平及其与预后的关系研究较少[4]。本文对miR-126表达水平及miR-126与预后的关系进行分析，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年5月至2016年12月本院收治的AML患儿58例，纳入研究组，均符合《儿童急性髓细胞白血病诊疗建议》[5]中AML诊断标准，纳入标准：①均首诊为AML，经骨髓形态学、细胞组织化学染色、细胞免疫分型、细胞遗传学及分子生物学检测确诊；②既往无肿瘤病史，年龄在14岁以下，确诊后采用标准化诱导方案进行化疗；③患儿监护人签署相关知情同意书。排除标准：①治疗相关性白血病、21三体综合征相关性白血病、中枢神经系统白血病、急性早幼粒细胞白血病等；②合并其他肿瘤或未按标准完善相关检查者。同时选取同期入院的非恶性病儿童（特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮）30例为对照组，研究组中男31例，女27例；年龄2～13岁，平均年龄（7.45±1.11）岁，对照组中男16例，女14例；年龄1～13岁，平均年龄（7.42±1.15）岁，2组在性别、年龄等一般资料方面对比差异无统计学意义（P＞0.05）。依据出院时miR-126表达量相对水平将58例AML患儿分为高表达组、低表达组各29例，另根据《儿童急性髓细胞白血病诊疗建议》[5]将AML患儿分为临床高危、中危、低危各16、20、22例，并依据预后情况分为完全缓解组、难治复发组、死亡组各18、26、14例，各亚组间一般资料比较差异也无统计学意义（P＞0.05）。本研究经我院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂/仪器

7300Real-time PCR仪购自美国Applied Biosystems公司，Power/PAC200水平电泳仪购自美国Bio-RAD公司，凝胶成像分析仪购自美国UVP公司。miRNA提取、探针、逆转录试剂盒与PCR扩增酶均购自美国Applied Biosystems公司；引物序列购自北京英俊生物技术有限责任公司。

1.2.1 miR-126表达水平测定

从标本库中抽取其骨髓标本，采用TaqMan RT-PCR法检测2组骨髓标本中miR-126的表达，进行总RNA抽提及miR-126特定的c DNA反转录，miR-126的提取依据试剂盒说明书进行操作，测定其浓度及OD260/280，在1.8～2.0者用于实时PCR检测，浓度调整至2ng/μL，依据MicroRNA Assays说明书进行操作，选择U 6作为内参照，引物 序 列：miR126：5′UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG3′，U6：5′CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3′，均进行逆转录，转录条件：反应体系15μL[dNTP（100mM）0.15μL，逆转录酶（50U/μL）1.0μL，10×RTBuf fer1.5μL，RNA酶抑制剂（20U/μL）0.19μL，无RNA酶水4.16μL，RTmiR126/RT-U6探针3μL，RNA 5μL]，16℃30min；42℃30min；85℃5min；4℃，保持；反应产物于-20℃保存备用，依据产品说明书进行操作，PCR扩增总体系：20μL[TagMan扩增酶（20×）1μL，无RNA酶水7.67μL，TagMan2×Universal PCRMaster Mix（No Amp Erase UNG 10.0μL，逆转录产物1.33μL]，50℃2min；19℃10min，95℃15s，60℃1min，循环40个，依据CT值，分析以β-action、U6为内参照，利用Ct值计算各组miR-126表达相对量，相对量=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=ΔCt（试验样本）-ΔCt（校准样本），ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（β-action），基因表达差异的倍数即2-ΔΔCt。

1.2.2 AML治疗方案

以柔红霉素（daunorubicin，DNR）、阿糖胞苷（cytarabine，Ara-C）[DA，3+7方案]或DNR、Ara-C联合依托泊苷（etoposide，VP16）[DAV，3+7+3方案]进行治疗，具体为：①DA方案：DNR 30mg/（m2·d），第（1～3天）；Ara-C100～200mg/（m2·d），第（1～7天）；②DAV方案：DNR、Ara-C同上，另联合VP16100mg/（m2·d），第（5～7天）。待患儿获得骨髓缓解后，继续按原方案完成2疗程巩固治疗；巩固治疗后，完成5～6次大剂量Ara-C为主的强化治疗，前3次连续应用，后3次与标准剂量Ara-C交替应用。总疗程9～12个月。

1.2.3 随访及预后判断

均完成1年随访，完全缓解（complete remission，CR）[6]：诱导缓解治疗后第8复查骨髓达缓解标准，且持续3个月以上未见异常。难治复发性AML标准[7]：①标准方案诱导化疗2个疗程未获得CR；②第一次CR后6个月内复发；③第一次CR后6个月内复发、经原方案再诱导化疗失败；④2次或2次以上复发；⑤髓外白血病持续存在。

1.3 观察指标

①比较研究组（分为高危、中危、低危）、对照组入院时骨髓标本中miR-126表达量；②依据出院时miR-126表达量相对水平将58例AML患儿分为高表达组、低表达组各29例，比较2组miR-126表达量及中位生存时间、无事件生存时间、中位生存率，中位生存时间：自诊断起至死亡或末次随访时间，无事件生存时间：诊断至第一次事故发生或末次随访时间，事故包括复发、死亡与失访；③依据1年内随访结果将其分为完全缓解组、难治复发组、死亡组，比较3组入院时、出院时、末次随访时miR-126表达量；④分析AML患儿miR-126表达水平与其预后的关系。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件处理数据，计数资料以%表示，采取χ2检验，计量资料以（±s）表示，行t检验，高危、中危、低危患儿miR-126表达量及完全缓解组、难治复发组不同时点miR-126表达水平采用重复测量数据的方差分析（F检验），相关分析采用Spearman相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究组、对照组骨髓标本中miR-126表达量

研究组骨髓标本中miR-126表达量明显高于对照组（P＜0.05）；研究组中，高危患儿miR-126表达量高于中危、低危患儿，中危、低危患儿miR-126表达量比较差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

2.2 miR-126高表达组、低表达组miR-126表达量及预后情况比较

出院时miR-126高表达组miR-126表达量高于miR-126低表达组，而中位生存时间、无事件生存时间、中位生存率短/低于低表达组（P＜0.05）（表2）。

表1 研究组、对照组骨髓标本中miR-126表达量比较Table1 Comparison ofmiR-126 expression in bonemarrowsamples of study group and controlgroup

2.3 完全缓解组、难治复发组、死亡组患者miR-126表达水平比较

3组出院时、末次随访时miR-126表达水平均明显低于同组入院时，且完全缓解组出院时、末次随访时miR-126表达水平较难治复发组、死亡组低，难治复发组、死亡组miR-126表达水平差异也有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

表2 miR-126高表达组、低表达组miR-126表达量及预后情况比较[n=29，（%）]Table2 Comparison ofmiR-126 expression and prognosis inmiR-126 high expression group and lowexpression group[n=29，（%）]

表3 完全缓解组、难治复发组、死亡组患者miR-126表达水平比较[n，（±s）]Table3 Comparison ofmiR-126 expression in complete remission group and refractory recurrence group[n，（±s）]

表3 完全缓解组、难治复发组、死亡组患者miR-126表达水平比较[n，（±s）]Table3 Comparison ofmiR-126 expression in complete remission group and refractory recurrence group[n，（±s）]

注：与同组入院时比较，aP＜0.05；与完全缓解组比较，bP＜0.05；与难治复发组比较，cP＜0.05。

组别完全缓解组（n=18）难治复发组（n=26）死亡组（n=14）F值P值入院时1.78±0.111.75±0.09 1.78±0.08 F交互=18.976，F组间=7.865，F时点=11.329 P交互=0.000，P组间=0.004，P时点=0.000出院时1.34±0.25a 1.54±0.20ab 1.67±0.17abc 末次随访时1.12±0.13a 1.24±0.21ab 1.41±0.15abc

2.4 AML患儿miR-216表达水平与其预后的关系分析

相关性分析结果显示，AML患儿入院时miR-216表达水平与其中位生存时间、无事件生存时间、中位生存率呈负相关（P＜0.05）（表4）。

表4 AML患儿miR-216表达水平与其预后的关系分析Table4 The relationship betweenmiR-216 expression and prognosis in children with AML

3 讨论

儿童AML可发生在任何年龄，无明显性别差异。国际法美英（French，American and British，FAB）协作组根据形态学将其分为M0～M7共8种亚型，其中M3（急性早幼粒细胞白血病，acute promyelocytic leukemia，APL）是较特殊类型的AML[8]。随着化疗药物发展，APL成为可以治愈的恶性白血病，但超过1/3的非APL的AML患儿预后不良，因此分析疾病相关特征及与患儿预后的关系是儿科医师重点课题[9-10]。miRNA为一类长度为19～25个核苷酸的内源性非编码小RNA，在基因网络系统中发挥主要的“调控节点”作用，可在转录或转录后水平调节基因的表达，以抑制翻译或降解蛋白质[11]。近年来miRNA在血液系统疾病造血链分化中的作用及癌基因与抑癌基因的双重作用受到重视[12]。miR-126为位于9q34.3的内皮细胞特异性miRNA，可通过靶基因介导血管内皮细胞对内皮细胞生长因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGF）的反应，在血管生成过程中发挥重要作用。张艳等[13]的研究结果显示成人AML患者骨髓中miR-126相对表达水平较正常人群增高，尤其在M3型AML患者中表达水平明显低于非M3型，可用于区分AML亚型。但目前关于miR-126在儿童中的表达水平及其与预后的关系研究较少。

Li等[14]的研究结果显示，miRNA-126与其反义链miRNA-126*在伴有t（8；21）与inv（16）染色体易位的AML中特征性过表达，在t（15；17）染色体变异的AML中，miRNA-126及miRNA-126*则下调。Li的进一步研究结果显示，miRNA-126与AML1/ETO融合基因协同抑制AML细胞凋亡，提高细胞活力，此外miRNA-126可通过负向调控PLK2基因，继而抑制AML恶性细胞凋亡，并促进其增殖。可见miR-126在AML中发生发展中起着重要作用，但其与预后的关系研究较少涉及。本次研究也表明AML患儿miR-126呈高表达状态，且随患儿临床危重程度增加，miR-126表达量升高。可能是因为，经剪切修饰的成熟miR-126进入RNA诱导的沉默复合物中，经结合靶mRNA的3′端非翻译区抑制靶mRNA表达，通过抑制翻译或降解靶mRNA的机制以实现相关调节，且随着临床病情加重这种机制更为明显[15]。在与预后的关系方面，本研究结果显示，出院时miR-126高表达组中位生存时间、无事件生存时间、中位生存率短/低于miR-126低表达组，表明出院时miR-126水平可较好预测AML患儿预后，低水平miR-126预示着预后更良好，这与Shibayama等[16]通过研究得出的microRNA-126-5p上调与阿糖胞苷耐药性和不良预后有关的结果相近。但因条件限制，本研究预后评估方面未涉及AML患儿阿糖胞苷的耐药性，且未对miR-126高表达预测不良预后的机制进一步进行分析，因此可将其作为后期进一步研究内容。本研究也显示，在出院时及随访中，完全缓解组miR-126表达水平均低于难治复发组、死亡组，难治复发组、死亡组miR-126表达水平差异也有统计学意义，且相关性分析结果也初步证实AML患儿miR-126表达水平与其预后存在一定关系，这与Li等[17]通过研究得出的AML患者miR-126高表达与不良生存率有明显相关性的结果一致。考虑是因为miR-126通过靶基因介导血管内皮细胞对内皮细胞生长的反应作用，使血管生成增多，因此miR-126水平高低可反映AML患儿病情并预测其预后水平与化疗疗效[18-19]，对miR-126的深入研究将会揭示AML新的发病机制，为其诊断提供新的分子标志物，为AML的治疗提供新思路。

综上所述，AML患儿miR-126表达水平与其预后密切相关，miR-126表达水平可预测远期预后，因此可将其作为临床治疗靶点及预后监测指标。