不同酶解胶原肽的制备及抗氧化活性研究

王 晴，曹稳根，钱玉梅，李红侠，陈红玲，郝 丽

(宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州 234000)

胶原蛋白是由3条α-肽链相互缠绕而形成的螺旋结构的纤维状蛋白质.胶原蛋白广泛分布于动物的皮肤、软骨、韧带、血管、肌腱等组织和器官中，具有调节细胞、支撑器官和保护机体的作用[1-2].胶原蛋白中蕴藏着许多生物活性肽，其是由胶原蛋白经酶降解得到的一系列由3～20个氨基酸组成的多肽，在体内的生理功能较稳定且易被肠道吸收，主要被应用于生物、医疗、食品和美容等方面，用来治疗骨质疏松，保护胃黏膜和抗溃疡，促进皮肤胶原代谢等[3].酶具有专一性、条件温和、过程安全、可准确控制水解程度等特点，且对氨基酸结构破坏和构型影响较小，因此酶解法是目前制备多肽应用最广、最有效的方法[4].王成成[5]用蛋白酶酶解胶原蛋白60 min和120 min制成罗非鱼鱼皮胶原肽，综合评价后表明，酶解60 min的胶原肽活性较大.由此可见，胶原肽活性跟其酶解因素有关，但酶种类对酶法所制备的胶原肽抗氧化活性的影响尚未见报道.

自由基是共价键发生均裂而形成的具有不成对电子的原子或基团，其化学性质极活泼.如果体内大量自由基存在，会与脱氧核糖核酸、蛋白质、脂质等生物大分子发生反应，造成器官、组织和细胞的功能衰退，引起一系列慢性疾病，并且加速衰老.而抗氧化剂能够和自由基发生氧化反应，减少人体内自由基对机体的损伤[6].DPPH是一种氮中心自由基，对蛋白质、脂质、核酸等大分子具有攻击作用，从而引发机体病变[7]；过氧化氢是一种非活性成分，广泛存在于生物体和食物中，当体系中存在还原性金属离子时，过氧化氢就会释放出氧化能力很强的羟自由基，羟自由基是一种较活泼、毒性较强的活性氧自由基，能够氧化机体内的蛋白质、脂质、核酸等生物大分子，造成人体组织中脂质的过氧化、核酸的断裂、多糖和蛋白质的分解，从而导致机体受损和基因突变，引起机体衰老和癌变[8]；超氧阴离子自由基是生命体代谢过程中产生的一种氧化能力较强的活性氧自由基，在机体中存在寿命最长，能引发体内脂质过氧化，加快机体衰老过程，并可诱发皮肤病变、心血管疾病、癌症等[9].

天然的抗氧化肽能清除自由基，且无毒副作用，对机体的抗衰老能力具有重要的作用.多肽抗氧化活性主要与其氨基酸序列、结构、分子质量和疏水性等相关，而这些因素受酶解方式的影响.胡杨等人研究表明，不同水解程度的胶原蛋白肽性能存在差异，使用不同蛋白酶进行水解，在水解程度相同时，所得胶原蛋白肽的性能也不相同[1]；肖岚等人研究表明5种蛋白酶水解猪皮胶原蛋白的水解产物抗氧化活性强弱不同[10].

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

罗非鱼鱼皮购于湖北发夏食品有限公司；羟脯氨酸、氯胺T、石油醚、对二甲氨基苯甲醛、三氯乙酸、酪蛋白、甘氨酸、30%双氧水、硫酸亚铁、硫酸铜、水杨酸、抗坏血酸、焦性没食子酸、DPPH均为分析纯，购于上海国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶购于合肥博美生物科技有限公司.

1.2 试验仪器

ED56精密烘箱(德国binder公司)；K1100全自动凯氏定氮仪(山东海能科学仪器有限公司)；UV-2450紫外分光光度计(日本岛津公司).

1.3 试验方法

1.3.1 鱼皮胶原蛋白的制备

鱼皮去除鱼鳞后清洗烘干，粉碎，用石油醚浸泡，并于室温下磁力搅拌6 h，然后用蒸馏水冲洗三遍，烘干即得脱脂鱼皮粉末.将脱脂鱼皮粉末按1∶100放入含有1 g/L胃蛋白酶的预冷的0.5 M乙酸溶液，连续搅拌提取48 h，20 000 g离心1 h，取上清，缓慢加入NaCl至最终浓度为0.9 M，盐析过夜，然后2500 g离心30 min，弃上清.将沉淀溶解于含1.0 M NaCl的Tris-HCl缓冲液(pH =7.5)中，再次于20 000 g离心1 h，取上清对0.1 M乙酸透析脱盐48 h，冻干即为罗非鱼鱼皮胶原蛋白[11].

1.3.2 不同酶解胶原肽的制备

取罗非鱼鱼皮胶原蛋白1 g，加入100 mL磷酸盐缓冲液(0.02 mol/L，pH= 8.0)制成10 g/L的胶原蛋白溶液，各取30 mL分别加入胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶若干(酶活控制在3 600 U/mL)，调pH至8.0，47℃下搅拌酶解3.5 h，100℃灭酶10 min，冷却后8 000 r/min离心4 min，取上清分别得到胰蛋白酶胶原肽、碱性蛋白酶胶原肽、中性蛋白酶胶原肽[4].

1.3.3 不同酶解胶原肽水解度测定

采用茚三酮比色法测定三种胶原肽水解度DH(Degree of hydrolysis)[5]，按(1)式计算：

DH(%)=(A-B)/C×100

(1)

式中A为蛋白酶水解后氨基氮的含量, B为原料中游离氨基氮的含量，C为原料经强酸水解后总游离氨基氮的含量.

1.3.4 不同酶解胶原肽对DPPH自由基的清除作用

取5支比色管，加入3 mL 0.05 mmol/L的DPPH溶液，再分别加入质量浓度分别为0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L的胰蛋白酶胶原肽3 mL，摇匀，静置30 min，于517 nm处测其吸光度Ai；另取5支比色管，分别加入3 mL无水乙醇和3 mL上述质量浓度样液，混合均匀，于517 nm处测其吸光度Aj；另取比色管，加入3 mL无水乙醇和3 mL DPPH溶液，摇匀，于517 nm处测定其吸光度A0.以Vc做对照，按相同方法测定碱性蛋白酶胶原肽和中性蛋白酶胶原肽对DPPH自由基的清除率[12]，按(2)式计算，并重复3次取其平均值.

DPPH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(2)

1.3.5 不同酶解胶原肽对·OH自由基的清除作用

取6支比色管，加入不同质量浓度(0.5 g/L、0.6 g/L、0.7 g/L、0.8 g/L、0.9 g/L、1.0 g/L)的胰蛋白酶胶原肽2 mL，再分别加入0.5 mL 6 mmol/L的硫酸亚铁溶液、2 mL 1.5 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液和0.5 mL 0.1%的H2O2溶液，摇匀，并置于37℃水浴中反应15 min，在510 nm处测定其吸光度Ai；以等量蒸馏水代替H2O2，测其吸光度Aj；以等量蒸馏水代替不同质量浓度的胰蛋白酶胶原肽，测其吸光度A0.用相同方法测定其他两种胶原肽及Vc对·OH的清除效果[13]，按(3)计算，并重复3次取其平均值.

·OH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/ A0]× 100 %

(3)

(4)

2 结果与分析

2.1 酶种类对胶原肽水解度的影响

蛋白质的水解度DH代表蛋白质被酶催化水解的程度.在酶解法制备胶原肽中，水解程度至关重要，合适的水解程度不会破坏水解物的组成和结构，可保留甚至增加其特性；过度水解可能会使其性能，尤其是功能特性和生物活性降低甚至完全丧失[1].酶种类对胶原肽水解度的影响见图1.

胶原肽

图1 酶种类对胶原肽水解度的影响

由图1可知，碱性蛋白酶水解罗非鱼鱼皮胶原蛋白得到的胶原肽的水解度最高，中性蛋白酶次之，胰蛋白酶最低，说明碱性蛋白酶的水解能力较强，与胡杨等人研究的酶法制备草鱼鱼鳞胶原肽结果一致[1].

2.2 不同酶解胶原肽对DPPH自由基清除效果的影响

不同酶解胶原肽对DPPH自由基清除作用的影响效果见图2.由图2可知，碱性蛋白酶胶原肽对DPPH自由基的清除率随浓度增大一直呈持续增长的趋势.在浓度为0.5 g/L时清除率为49.92%，浓度为2.5 g/L时，清除率达到98.93%；胰蛋白酶胶原肽对DPPH自由基的清除率从0.5 mg/mL时的47.21%增加到2.5 mg/mL时的88.73%；而中性蛋白酶胶原肽对DPPH自由基的清除率从0.5 mg/mL时的45.39%增加到2.5 mg/mL时的93.90%，且在浓度0.5～1.0 g/L范围内增加缓慢，而后增加速率较快.可明显看出，碱性蛋白酶胶原肽对DPPH自由基的清除率高于其他两种酶，且在浓度为2.5 g/L时，清除作用超过Vc.

图2 不同酶解胶原肽对DPPH自由基清除作用的影响

2.3 不同酶解胶原肽对·OH自由基清除作用的影响

不同酶解胶原肽对·OH自由基清除作用的影响效果见图3.由图3可知，碱性蛋白酶胶原肽在浓度2～10 g/L范围内，清除率从68.52%上升到95.28%，且在浓度2～8 g/L范围内增加较快，后增加缓慢；中性蛋白酶胶原肽对·OH自由基的清除率比碱性蛋白酶胶原肽清除率低，随浓度上升呈增加趋势，清除率从46.22%增加到85.79%，在2～5 g/L浓度范围内增加趋势较明显，清除率达到73.82%后增加缓慢；胰蛋白酶胶原肽对·OH自由基的清除率略低于中性蛋白酶胶原肽.碱性蛋白酶胶原肽、中性蛋白酶胶原肽、胰蛋白酶胶原肽对·OH自由基的清除率在浓度为10 g/L时均达到最高，分别为95.28%、85.79%、84.73%，说明三种胶原肽对·OH具有一定的清除效果，碱性蛋白酶胶原肽对·OH的清除效果最好，且当浓度为10 g/L时，其清除率与Vc相当，胰蛋白酶胶原肽和中性蛋白酶胶原肽对羟自由基的清除作用相差不大.

图3 不同酶解胶原肽对·OH自由基清除作用的影响

2.4 不同酶解胶原肽对自由基清除作用的影响

图4 不同酶解胶原肽对O2-·自由基清除作用的影响

3 结论与讨论