甜菊醇调控巨噬细胞ABCA1蛋白表达

李 妍，杨艳宇，刘婷婷，李 月，李 成*

（1.大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连116034；2.营口市环境监测站，辽宁 营口115000）

甜菊糖作为一种天然甜味剂，是从甜叶菊中提取的一种低热量的天然甜味剂，对高血压、糖尿病、肥胖病等具有治疗作用[1-4]。有研究表明，甜菊糖喂养的小鼠，其体内胆固醇及血糖等指标有不同程度的下降，认为甜菊糖对动脉粥样硬化导致的疾病具有重要的调控作用[5-6]。动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是冠心病、脑梗死、外周血管病等相关心脑血管类疾病的重要成因[7-8]。研究表明，当血管内的巨噬细胞不断吞噬胆固醇后，出现“泡沫化”现象，形成泡沫细胞，泡沫细胞渗透到动脉壁后，细胞内胆固醇释放，促进AS的病程发展[9]。介导巨噬细胞内胆固醇流出的主要蛋白质是ABCA1蛋白，它能够有效介导巨噬细胞胆固醇的外流，对巨噬细胞内胆固醇流出的调节起关键作用[10-12]。因此，寻找能够提高ABCA1蛋白表达的小分子药物前体，对AS的预防及治疗都具有非常重要的意义。

研究表明，甜菊糖在机体消化道的下段会被盲肠内微生物分解为甜菊醇[3]。因此，研究人员认为，甜菊糖被食用后，甜菊醇是其进入机体并参与代谢系统的主要化学成分。据此推测，甜菊醇作为甜菊糖的衍生物，是调控机体胆固醇代谢的主要物质[13]，但其使用条件尚不明确。作者以小鼠巨噬细胞J774A.1为模型，检测了甜菊醇对胆固醇转运重要蛋白ABCA1表达的影响，初步探讨了甜菊醇调控ABCA1的作用机制，为后续治疗和预防AS奠定了一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料小鼠单核巨噬细胞J774A.1：上海富衡生物有限公司。

1.1.2 主要试剂DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）、25%胰蛋白酶、青霉素/链霉素：Gibco公司；CPT和STE：Sigma公司；NP-40裂解液、蛋白酶抑制剂、PMSF、DAPI染色液、Alexa Fluor 555荧光二抗、抗荧光猝灭剂、山羊血清工作液、ECL显影液：上海碧云天公司；qRT-PCR试剂盒、RNA提取试剂盒：北京天根有限公司；兔抗鼠PPAR-α一抗、HRP标记的山羊抗兔IgG、兔抗鼠β-actin一抗、兔抗鼠ABCA1一抗、兔抗鼠LXRα一抗：北京全式金公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器MultiskanGo酶标仪：Thermo Scientific（中国）公司；CO2细胞培养箱：三洋电机株式会社；倒置荧光显微镜：奥林巴斯（中国）有限公司；LightCycler 480Ⅱ荧光定量PCR：罗氏诊断产品（上海）有限公司；Tanon-5200Multi凝胶成像仪：上海天能科技有限公司。

1.1.4 引物利用Primer 5.0软件分别设计反转录内参引物qT-GADPH、qT-ABCA1、qT-LXRα、qTPPARγ、qT-PPARα的荧光定量PCR引物，特异性引物序列见表1。

表1 各个基因的引物序列Table 1 Sequence of different primers

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养将小鼠单核巨噬细胞J774A.1在10%胎牛血清的DMEM培养液（100 U/mL的青霉素和100 U/mL的链霉素）中进行培养，置于体积分数5%CO2，饱和湿度为100%的恒温细胞培养箱中孵育培养，每48小时换一次液，细胞密度达80%以上时进行一次传代，使用倒置显微镜观察细胞的生长情况。

1.2.2 CPT处理小鼠巨噬细胞J774A.1设置了6个CPT浓度梯度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μmol/L），与小鼠巨噬细胞J774A.1细胞共同孵育24 h，以DMEM培养基处理的细胞作对照组，利用MTT[14]检测CPT对细胞活性的影响。

1.2.3 STE处理小鼠巨噬细胞J774A.1确定了CPT的添加浓度后，不同浓度的STE（5、10、25、50、75、100、125μmol/L）处理24 h后，MTT法分析其对小鼠巨噬细胞（J774A.1）活性的影响。

1.2.4 反转录获得cDNA第一链4℃、3 000 r/min离心5 min后收集细胞。采用天根微量样品总RNA提取试剂盒提取各个处理组细胞样品的总RNA[15]。琼脂糖电泳鉴定后，参照反转录试剂盒的使用说明，以细胞总RNA为模板，反转录获得cDNA第一链。

1.2.5 荧光定量PCR检测目标基因的表达情况以各组的cDNA为模板，利用荧光定量PCR法检测ABCA1、LXRα、PPARγ和PPARα的表达情况，内参基因为GADPH。其中，反应条件95℃，20 s；Tm根据各组引物的退火温度确定；56℃，20 s；72℃，20 s；40个循环，采用2-△△CT法计算各个基因的相对表达量[16]。

1.2.6 提取细胞全蛋白质每组细胞样品加入80 μL裂解液（2%NP40中加入蛋白酶抑制剂、EDTA、3μL 100 mmol/L PMSF），冰上重悬细胞，静置30 min。13 000 r/min离心收集上清液。采用凯基BCA蛋白质含量检测试剂盒（BCA法），对获得的全蛋白质提取物进行蛋白质定量。

1.2.7 免疫蛋白印记检测目标蛋白质的表达情况取各组样品的全蛋白质提取物，进行SDS-PAGE电泳分离，转至PVDF膜后，进行免疫蛋白印记（Western-Blot）检测ABCA1、LXRα和PPARα的表达情况。凝胶成像仪分析免疫印迹条带的相对灰度值，以反映各个蛋白质的相对表达量，每组相对灰度值的计算以β-actin蛋白作为内参。

1.2.8 免疫荧光技术检测目标蛋白质在细胞内的表达情况各组细胞用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次后加入0.1%Triton X-100处理10 min，加入山羊血清工作液（5%），湿盒内室温封闭2 h后加入稀释好的一抗（1∶200兔抗小鼠，3%山羊血清工作液），4℃过夜孵育。加入稀释好的Alexa Fluor 555荧光二抗（1∶2 500）后，室温、避光孵育1 h。DAPI（每孔10μL）复染细胞核15 min后，滴加抗荧光猝灭剂，各组样品置于荧光显微镜下观察。

1.2.9 统计学分析采用SPSS软件对数据进行分析处理[17]。两组间数据比较采用单因素T检验，多组间数据比较采用单因素方差分析。以p＜0.05（*）表示数据间差异显著，p＜0.01（**）表示数据间差异极显著。数据中的误差线表示至少3个生物学重复的标准误差。

2 结果与分析

2.1 单独的STE不能调控J774A.1细胞ABCA1的表达

检测了STE对J774A.1细胞ABCA1蛋白表达的调控作用。首先检测了STE对细胞的毒性作用。MTT检测结果发现，在较大的浓度范围内（0～100 μmol/L），STE对小鼠巨噬细胞几乎无毒性；125 μmol/L的STE作用于巨噬细胞时，J774.1细胞出现了一定程度的死亡，存活率为87.1%（p＜0.05），见图1（a）。选取适中浓度的STE（50μmol/L）进行后续实验，结果见图1（b）。和对照组比较，50μmol/L STE处理的细胞的ABCA1的表达量没有出现明显的变化。这表明，单独的STE不会影响小鼠巨噬细胞J774A.1上ABCA1的表达。

图1 STE对小鼠巨噬细胞（J774A.1）活性的影响以及STE对ABCA1蛋白表达的调控Fig.1 Effects of STE on the activity of mouse macrophages J774A.1 and the function of STE on the expression of ABCA1

2.2 确定STE/CPT的使用浓度

因为甜菊醇可以降低小鼠肠道细胞的ATP含量[6]，从而影响第二信使cAMP，而ABCA1的表达会受cAMP含量的影响。基于上述原因，在使用STE的同时，将加入cAMP类似物CPT[18]来调控胞内的cAMP水平。利用MTT法首先确定了CPT可使用浓度，结果见图2（a）。在较低的CPT浓度范围时（≤0.8μmol/L），CPT的添加未对细胞造成任何损伤和毒性。当CPT浓度升至1.0μmol/L时，J774A.1细胞出现了一定程度的损伤。基于MTT结果，确定0.2～0.8μmol/L的CPT浓度均可用于后续研究，作者选择0.4μmol/L的CPT与STE共同处理细胞。

图2 CPT和CPT/STE对J774A.1细胞活性的影响Fig.2 Effects of CPT and CPT/STE on the activity of J774A.1

在添加CPT的基础上，引入不同浓度（0、5、10、25、50、75、100、125μmol/L）的STE。由于CPT和STE的共同引入，对小鼠巨噬细胞J774A.1的活性均有一定的毒副作用。当STE为5～50μmol/L时，细胞的活性＞90%；随着STE浓度的增加（75～125 μmol/L），细胞的活性降至对照细胞活性的70%左右，见图2（b）。选取50μmol/L STE和0.4μmol/L CPT共同处理细胞，研究其对小鼠巨噬细胞ABCA1蛋白表达的作用。

2.3 STE/CPT上调J774A.1细胞ABCA1蛋白的表达

设置了4个实验组，Western blot检测不同处理条件下小鼠巨噬细胞内ABCA1的表达情况，结果见图3。与对照组相比，单独STE不能影响ABCA1的表达。CPT处理后，ABCA1的表达出现上调，灰度值约是对照组的2.8倍（p＜0.05）。STE/CPT处理组细胞内ABCA1的表达大幅上调，灰度值约是对照组的20倍（p＜0.01）。免疫印迹结果初步表明，在CPT的基础上，STE可以显著上调小鼠巨噬细胞内ABCA1在蛋白质水平的表达。

图3 Western blot检测ABCA1蛋白的表达Fig.3 Expression of ABCA1 protein detected by western blot

进一步利用细胞免疫荧光技术在细胞水平直接检测ABCA1的蛋白质表达情况，结果见图4。其中，蓝色荧光为DAPI染色后的细胞核，红色荧光为Alexa Fluor 555二抗特异识别的ABCA1蛋白。结果表明，对照组细胞和单独STE处理的细胞内，ABCA1的表达量相对较低，视野内没有出现明显的红色荧光；CPT处理后，细胞内依稀可见红色荧光，但强度较弱；当用STE/CPT处理时，胞内红色荧光的强度明显增加，见图4。细胞免疫荧光的结果与Western Blot几乎一致，即单独的STE对小鼠巨噬细胞J774A.1上ABCA1的表达没有明显的调控作用，但是在CPT的基础上，STE的添加可以显著增加ABCA1在蛋白质水平的表达。

图4 免疫荧光检测细胞（J774A.1）上ABCA1蛋白的表达情况Fig.4 Expression of ABCA1 protein in J774A.1 cells detected by immunofluorescence

荧光定量PCR进一步检测STE对ABCA1蛋白在mRNA水平的调控作用，结果见图5。相较于对照组，单独STE处理时，细胞ABCA1的mRNA水平没有明显变化；单独的CPT处理时，细胞内ABCA1的表达量出现了明显上调，约是对照组的19.4倍左右（p＜0.05）；但是，当细胞以STE/CPT共同处理时，相较于其它组别，ABCA1的mRNA水平大幅度上调，是对照组的36.9倍左右（p＜0.01）。这表明在CPT的基础上，STE也能提高小鼠巨噬细胞ABCA1在mRNA水平上的表达。

图5 荧光定量PCR检测细胞（J774A.1）中ABCA1蛋白的mRNA表达情况Fig.5 Expression of ABCA1 mRNA detected by QRTPCR

结果表明，单独STE不能调控ABCA1的表达，可能是细胞内ATP转化被抑制，降低了cAMP的浓度，从而影响了细胞信号通路的转导过程；而CPT的添加可以抵消STE对细胞能量转化途径的负作用。同时，在CPT的基础上，STE能显著提高小鼠巨噬细胞（J774A.1）ABCA1蛋白在蛋白质及mRNA水平上的表达。

2.4 STE调控ABCA1表达机制的初步探讨

ABCA1在体内受多种因素调节，研究发现，LXRα和PPAR家族受体被认为是调控ABCA1基因表达的主要核受体[19]。LXRα主要是通过和视黄醇类X受体RXR组成的异源二聚体LXR/RXR来识别ABCA1基因启动子上的DR-4元件，进而启动ABCA1的表达[20]。PPAR家族受体不能直接调控ABCA1基因启动子的表达，而是通过LXRα进行间接调控，因此PPAR→LXRα是研究较多的ABCA1调控通路。

Western Blot和qRT-PCR检测发现，STE/CPT均能上调LXRα在蛋白质和mRNA转录水平的表达，结果见图6。在蛋白质水平上，单独STE处理后细胞内LXRα没有出现明显变化；CPT可以提高LXRα蛋白的表达量约3倍（p＜0.01）；当STE/CPT共同作用后，LXRα的表达量是对照组的4倍左右（p＜0.01），见图6（a）。在mRNA水平上，相比于对照组和STE处理组，CPT处理时，LXRα的mRNA水平约是对照组的3.6倍（p＜0.05）；STE/CPT共同处理时，LXRα的mRNA水平显著提高，约是对照组的5.2倍（p＜0.01），见图6（b）。这表明STE/CPT能在mRNA和蛋白质水平上显著提高ABCA1上游调控因子LXRα的表达。

图6 STE/CPT共同作用对LXRα蛋白和mRNA表达水平的影响Fig.6 Effect of STE/CPT on the expression of LXRα protein and mRNA

研究发现，PPARs家族受体能够调控胆固醇的有两个成员，PPARα和PPARγ，LXRα是二者下游的靶基因[21]。荧光定量检测结果发现，STE/CPT共同处理24 h后，PPARγ的mRNA表达没有出现变化，即STE/CPT不能调控PPARγ的表达水平，见图7。

图7 STE/CPT共同作用对PPARγmRNA表达的影响Fig.7 Effect of STE/CPT interaction on PPARγmRNA expression

进一步分析了STE/CPT对PPARα表达的影响，结果见图8。相较于对照组，单独CPT处理时，细胞内PPARα的表达量出现了明显上调，是对照组的4倍左右（p＜0.05）；当细胞以STE/CPT共同处理时，单独的STE和单独CPT处理组中，PPARα的mRNA水平显著上调，约是对照组的5.13倍（p＜0.05），见图8（a）。因此，STE/CPT共同处理后，可以在转录水平上显著提高调控因子PPARα的表达水平。Western Blot结果表明，单独的STE处理不影响PPARα蛋白的表达量，单独CPT处理使PPARα蛋白的表达量提高了2倍多。STE/CPT共同作用后，PPARα蛋白表达量约是对照组的3.4倍（p＜0.01），见图8（b）。这表明，STE/CPT可以显著提高小鼠巨噬细胞J774A.1 PPARα在蛋白质水平上的表达。

图8 STE/CPT共同作用对PPARαmRNA和蛋白质表达水平的影响Fig.8 Effects of STE/CPT on the expression of PPARα mRNA and protein

综上所述，初步推测STE/CPT能上调ABCA1的表达可能是通过PPARα-LXRα-ABCA1的通路途径。

3 结语

胆固醇是细胞膜的重要组成部分，在机体的信息传递、胆汁酸合成以及激素合成中扮演着重要的角色。目前心脑血管类疾病的发病率一直居高不下，然而过多的胆固醇会引发动脉粥样硬化性疾病。机体对胆固醇分泌的调节机制非常复杂，其中胆固醇逆转运是机体胆固醇代谢的重要途径，也是近年来国内外研究的热点。ABCA1在胆固醇的逆转运过程中具有重要作用，如果能够根据机体脂肪代谢的需要，有效地调节ABCA1的表达水平，对机体的脂代谢和AS的治疗具有重要意义。

甜菊糖，又称甜菊糖、甜菊糖苷，是从植物甜叶菊中提取的新型天然甜味剂。国外早有使用甜叶菊作为药草和代糖的历史。我国是甜菊糖的主要生产国。目前，甜菊糖已在世界各地广泛应用于食品、饮料、调味料的生产。甜菊糖的热量极低，摄入人体后不被吸收，也是糖尿病和肥胖病患者适用的甜味剂。研究表明，甜菊糖兼具有药理活性，能够预防动脉粥样硬化、高血糖、高血压等疾病，还可以作为免疫增强剂使用[22-24]。研究发现，甜菊糖会被肠道内的微生物降解为甜菊醇，部分甜菊醇会被肠道吸收，经由肝脏，然后通过血液，最后从肾脏排出体内[25]。据此推测甜菊糖的许多生理功与甜菊醇具有密切关系。研究发现，STE可以有效地调节小鼠巨噬细胞ABCA1的mRNA和蛋白质的表达水平，这一结果给AS相关疾病药物的开发提供了相关的理论依据。

由于甜菊醇可以降低小鼠肠道细胞对葡萄糖的吸收，从而降低肠道细胞内的ATP含量；另外，甜菊醇对细胞的呼吸链也有明显的抑制作用，从而使胞内ATP的生成和转化出现抑制，降低了其ATP含量[6，26-28]。我们知道，细胞内重要的第二信使cAMP来源于ATP的转化，当胞内ATP下降时必然会导致cAMP的转化受阻，而ABCA1的表达与胞内cAMP的水平密切相关。研究发现cAMP及其类似物会调控巨噬细胞RAW264的质膜蛋白ABCA1的表达[29]。基于上述原因，我们推断，甜菊醇的加入应该通过抑制ATP的形成，从而影响了胞内cAMP的生成，使ABCA1的表达受到抑制。本研究也证实了单独的CPT同样也可以显著上调小鼠巨噬细胞ABCA1的表达水平。基于上述原因，在使用STE的同时，加入cAMP类似物CPT来调控胞内cAMP水平。STE必须在添加了cAMP类似物CPT的基础上，才能显著提高巨噬细胞胆固醇转运蛋白ABCA1的表达水平。

ABCA1在体内受多种因素调节，包括上调ABCA1基因表达的LXR家族受体、PPAR家族受体和炎症因子TGF-β，以及下调ABCA1基因表达的TNF-α、IL-1β和TNFγ等，其中LXR家族受体被认为是调控ABCA1基因表达的主要核受体[19]。研究发现，STE/CPT能够上调机体重要的核转录受体LXRα蛋白的表达。PPAR家族受体也是研究较多的调控因子，近期有研究发现，仙人掌多糖能够通过PPARγ→LXRα途径调控ABCA1的表达[30]。我们前期也检测了STE对PPARγ受体表达的影响，但是结果发现，STE不能调控PPARγ的表达。因为PPAR是一个成员众多的受体家族，PPARs家族受体PPARα也能参与机体的胆固醇的调控。进一步结果表明，STE能够上调机体重要的核转录受体PPARα在蛋白质水平和mRNA水平的表达。基于上述结果，我们初步推测，STE/CPT能够上调ABCA1的表达可能是通过PPARα-LXRα-ABCA1的通路途径。