王保平,童红梅*,宋巧
甘肃医学院(平凉 744000)
甜叶菊(Stevia rebaudiana(Bertoni)Hemsl)为一种富含甜菊糖苷的菊科植物[1-2]。甜菊糖苷在国际上被誉为“第三糖源”,其甜度约为蔗糖的300倍,热量仅为蔗糖的1/300,是高甜度、低热量的天然甜味剂[3]。甜菊糖苷能使减肥人士、糖尿病患者、高血压患者等忌糖人群摆脱无糖之苦,在第7次国际糖尿病会议上,甜菊糖苷被公认为糖尿病和高血压患者的理想甜味剂[4]。通过大量临床试验,甜菊糖苷安全无毒性得到认证。此外,甜菊糖苷还有降血糖、降血脂、防龋齿、抗肿瘤、利尿等药用价值。甜菊糖苷的价值受到重视,市场需求大,被广泛应用在食品、饮料、医药、日常化工等领域[5]。
甜叶菊中甜菊糖苷约有9种成分,其纯化测定极其复杂。常见的纯化方法有沉淀法、吸附法和膜分离技术[4-6]。沉淀法中,醇沉法相对化学絮凝法损失率低,不会引入其他杂质和无机离子且过程简单,但提取的甜菊糖苷纯度低且颜色深[7]。
试验以甘肃酒泉产的甜叶菊为材料,通过超声提取甜菊糖苷粗提样品,用乙醇沉淀、酸性氧化铝吸附、微孔过滤器膜过滤3种方法协同作用去除样品中杂质,探究甜菊糖苷纯化条件优化对甜菊糖苷得率的影响,以得到纯度较高的甜菊糖苷样品,解决生产中甜菊糖苷提取样品纯度低颜色深的问题。
甜叶菊(购自甘肃省酒泉市肃州区农贸市场,通过肃州区农业局农技科人员鉴别。冷藏于0 ℃的冰箱中备用)。
中药超声提取机(JBT/C-YCL500T/3P,山东金百特);Heidolp旋转蒸发仪(德国);微孔过滤器天津双吉实验材料经营部);紫外分光光度计(UV-1780);101-2型数显电热恒温鼓风干燥箱(上海锦屏仪器仪表有限公司);JP-1500B高速多功能粉碎机(永康市久品工贸有限公司);HZK-JA 210电子天平(福州华志科学仪器有限公司);SHHW600三用电热恒温水箱水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。
无水乙醇、氧化铝、蒽酮、浓硫酸(均为分析纯);甜菊糖苷标准品(STV,纯度>99.0%,日本和光纯药工业株式会社)。
1.4.1 甜菊叶预处理将甜叶菊干叶去杂去屑,水洗烘干(40 ℃、60 h)后粉碎粒度0.150~0.180 mm,干燥备用。
1.4.2 甜菊糖苷提取
取1 g冷冻干燥样品,液氮中充分研磨后按加入50%,60%,70%,80%和90%乙醇(料液比1︰50 g/mL),充分混匀后在功率200 W、60 ℃下超声处理40min,反复提取3次,合并滤液,旋转蒸干,对应乙醇体积分数定容后离心去掉沉淀,微孔过滤器膜过滤,取滤液得到粗提液。用蒽酮比色法进行定量分析,采用紫外分光光度计检测甜菊糖苷,按式(1)计算甜菊糖苷提取率。
1.5.1 甜菊糖苷提取率、纯度计算
称取10 g甜叶菊冷冻鲜样,样品提取方法同1.4.2小节,合并滤液并真空浓缩,干燥得粗甜菊糖苷浸膏。取2~3 g粗甜菊糖苷浸膏,置于25 mL容量瓶中,用不同体积分数乙醇超声溶解并定容至刻度线。按照标准曲线的制作方法在最大吸收波长621 nm处测定吸光度,按式(2)计算甜菊糖苷提取率。
式中:X为甜菊糖苷浸膏提取率,%;m1为甜菊糖苷浸膏质量,g;m2为甜叶菊叶质量,g。
式中:Y为甜菊糖苷提取率,%;C为样品甜菊糖苷质量浓度,mg/mL;m3为测得率时称取的粗甜菊糖苷浸膏质量,g;V为样品的体积,25 mL。
式中:Z为甜菊糖苷纯度,%;Y为甜菊糖苷提取率,%;m2为甜叶菊叶质量,g;m3为测得率时称取的粗甜菊糖苷浸膏质量,g。
1.5.2 甜菊糖苷标准曲线绘制
精准称取甜菊糖苷标准品,配制成0.20,0.30,0.40,0.50,0.60,0.70和0.80 mg甜菊糖苷标准品溶液,置于10 mL容量瓶中,用80%乙醇溶液定容,涡旋混匀后加0.30 mL 1.5%蒽酮溶液、2.00 mL浓硫酸,于80 ℃恒温水浴锅中显色15 min(蒽酮比色法),在621 nm波长处分别测定各反应体系的吸光度。以甜菊糖苷质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线如图1。线性回归方程为y=0.939 8x+0.199 1,相关系数r2=0.998 3。
按照1.4.2甜菊糖苷提取方法制备粗提液,溶于70%乙醇(料液比1︰20 g/mL),充分混匀后以超声功率200 W、提取温度75 ℃超声处理40 min,于80 ℃回流提取1 h,加入1︰5(g/mL)酸性氧化铝,于40 r/min室温振荡60 min,澄清后取上清液,0.3 μm微孔膜过滤。计算甜菊糖苷的提取率与纯度。结果见表1。
图1 甜菊糖苷标准曲线
表1 乙醇体积分数对甜菊糖苷提取率的影响
从表1可以看出,在超声提取条件相同的前提下,选用酸性氧化铝作为吸附剂,振荡吸附60 min,70%乙醇甜菊糖苷的提取率最高,可达26.35%;继续提高乙醇体积分数,甜菊糖苷提取率不但没有升高,反而在下降。由此可知,70%乙醇是提取甜菊糖苷的最佳体积分数。
按照1.4.2甜菊糖苷提取方法制备粗提液,用70%乙醇按照料液比1︰20,1︰30,1︰40,1︰50和1︰60(g/mL)加入,充分混匀后以超声功率200 W、提取温度75 ℃超声处理40 min,于80 ℃回流提取1 h,加入1︰5(g/mL)酸性氧化铝,在40 r/min室温振荡60 min,澄清后取上清液,经微孔过滤器膜过滤,用蒽酮比色法进行定量分析,采用紫外分光光度计检测甜菊糖苷,计算甜菊糖苷的提取率与纯度。结果见表2。
表2 料液比对甜菊糖苷提取率的影响
由表2可知,在超声提取条件相同前提下,选用酸性氧化铝作为吸附剂(1︰5 g/mL),振荡吸附60 min,70%乙醇提取甜菊糖苷,选用不同液料比,以料液比1︰40(g/mL)时提取率最高,甜菊糖苷提取率可达26.38%,过大或过小的料液比均不能提高甜菊糖苷的提取率。
准确称取4份1.000 g甜叶菊冻干粗粉,70%乙醇料液比1︰40(g/mL),超声时间60 min,提取温度75℃,分别在超声功率100,150,200,250和300 W下进行超声提取,经微孔过滤器膜过滤抽滤,滤液定容至100.00 mL,移取5.00 mL稀释至100.00 mL,计算甜菊糖苷的提取率与纯度。结果见表3。
表3 超声功率对甜菊糖苷提取率的影响
由表3可知,70%乙醇提取甜菊糖苷,料液比1︰40(g/mL),选用酸性氧化铝作为吸附剂(1︰5 g/mL),振荡吸附60 min,选用不同超声功率,以超声功率200 W时甜菊糖苷提取率最高,可达26.79%,过大或过小的超声功率均不能提高甜菊糖苷提取率。
准确称取6份1.000 g甜叶菊冻干粗粉,用70%乙醇提取,料液比1︰40(g/mL),超声时间40 min,超声功率200 W,分别在提取温度35,45,55,65和75 ℃下进行超声提取,经微孔过滤器膜过滤抽滤,滤液定容至100.00 mL,移取5.00 mL稀释至100.00 mL,计算甜菊糖苷提取率与纯度。结果见表4。
表4 提取温度对甜菊糖苷提取率的影响
由表4可知,用70%乙醇提取甜菊糖苷,料液比1︰40(g/mL),选用酸性氧化铝作为吸附剂(1︰5 g/mL),振荡吸附60 min,超声功率300 W,选用不同提取温度,提取温度65 ℃时甜菊糖苷提取率最高,可达26.57%,过高或过低的提取温度均不能提高甜菊糖苷提取率。
准确称取3份1.000 g冷冻干样品,液氮中充分研磨后按料液比1︰50(g/mL)加入70%乙醇,充分混匀后超声功率200 W、提取温度60 ℃处理40 min,重复提取3次,将滤液旋转蒸干,用70%乙醇定容后离心去掉沉淀,取滤液得到粗提液,溶于70%乙醇(料液比1︰20 g/mL),充分混匀后以超声功率200 W、提取温度65 ℃超声处理40 min,于80 ℃回流提取1 h,加入1︰5(g/mL)酸性氧化铝,在40 r/min室温振荡60 min,澄清后取上清液,经微孔过滤器膜过滤,滤液用蒽酮比色法进行定量分析,采用紫外分光光度计检测甜菊糖苷,计算甜菊糖苷提取率和纯度。结果见表5。
表5 乙醇沉淀法对甜菊糖苷提取纯度的影响
由表5可知,用70%乙醇提取甜菊糖苷,料液比1︰40(g/mL),选用酸性氧化铝作为吸附剂(1︰5 g/mL),振荡吸附60 min,超声功率200 W,提取温度65 ℃,经微孔过滤器膜过滤,甜菊糖苷提取率均值可达28.81%,甜菊糖苷纯度均值为88.63%。同参考资料相比,甜菊糖苷提取率和纯度均有所提高。
采用乙醇沉淀法提取甜菊糖苷,主要是甜菊糖苷易溶于乙醇,而蛋白质、纤维素等生物大分子不溶于乙醇,从而达到除杂目的;加之乙醇可回收循环利用,降低成本,便于工业生产大规模推广应用。结果表明,利用70%乙醇提取甜菊糖苷,以料液比1︰40(g/mL),选用酸性氧化铝作为吸附剂(1︰5 g/mL),振荡吸附60 min,超声功率200 W,提取温度65 ℃,经0.30 mm微孔过滤器膜过滤,可得甜菊糖苷提取率为28.81%,甜菊糖苷纯度为88.63%,样品颜色洁白,后味不苦[8]。但与商品甜菊糖苷相比(纯度96%以上)还有差距[9-10],有待进一步优化纯化条件。