反复发作抑郁症与5-羟色胺1A和5-羟色胺2A受体基因多态性的关联性研究☆

姚静 庞剑月 何瑾 冯婷婷 张淑绮 李恒芬

遗传是重性抑郁症（major depressive disorder，MDD）发病的因素之一，但至今仍缺乏MDD相关功能基因突变的定位或可用于临床的分子遗传学标记[1-3]。究其原因，除与影响功能基因蛋白表达的因素有关外，还与MDD表型异质性及遗传数据分析方法等有关[4-5]。既往研究发现，反复发作抑郁症 （recurrent major depressive disorder，RMDD）患者似乎存在更高的遗传倾向及复杂的临床表征[6-7]。5-羟色胺 1A 受体（5-hydroxytryptamine 1A receptor，5-HTR1A）和 5-羟色胺 2A受体（5-hydroxtryptamine 2A receptor，5-HTR2A）相关药物临床效应已揭示其与MDD关系密切，但有关两者基因多态性研究的结果多不一致[8-9]。标签单核苷酸多态性（tagging single nucleotide polymorphisms，tagSNPs）是第三代遗传学标记，利用tagSNPs探讨基因与疾病的关系，可大大缩小具有功能意义基因区域的寻找范围[10]。本研究纳入RMDD患者，结合有关5-HTR1A和5-HTR2A基因的文献及数据库，选取高连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）值倾向的tagSNPs位点，探讨RMDD与其关系，寻找RMDD的分子遗传学标记。

1 对象与方法

1.1 研究对象 病例组来自2005年11月至2017年5月（随访截点）郑州大学第一附属医院和新乡医学院第二附属医院门诊或住院的RMDD患者。纳入标准：①符合《美国精神障碍诊断与统计手册第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，Fourth Edition，DSM-IV）中重性抑郁障碍，反复发作的诊断标准；②24项汉密尔顿抑郁量表 （24-item Hamilton depression rating scale，HAMD-24）总分≥21分；③汉族；④年龄 18～65岁，性别不限；⑤随访3年以上。排除标准：①有脑器质性精神障碍或其他精神障碍病史；②有遗传性疾病家族史；③有精神发育迟滞或痴呆者；④有精神活性物质滥用史。共纳入1030例患者。

对照组来自2005年11月至2017年5月郑州大学第一附属医院、新乡医学院第二附属医院和河南科技学院校医院体检科的健康体检者。纳入标准：①无精神障碍病史；②HAMD-24总分＜7分；③汉族；④年龄18～65岁，性别不限。排除标准：①有遗传性疾病家族史；②有精神发育迟滞或痴呆者；③有精神活性物质滥用史。共纳入851名对照。

本研究经郑州大学第一附属医院伦理委员会批准。所有参与者均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 临床资料收集 采用自编人口学资料问卷收集受试者社会人口学资料，包括姓名、性别、年龄、民族、婚姻状况、工作状况、受教育程度等。病例组诊断由接受过DSM-Ⅳ疾病结构式临床访谈[11]（Structured Clinical Interview for the DSM-Ⅳ AxisⅠ Disorders，SCID-I）培训的2名高年资精神科医师 （主任医师或副主任医师）做出。入组受试者HAMD-24评估由2名研究员共同完成，先后共8名研究员，均接受过量表培训，并通过一致性检验（Kappa为0.87～0.95）。采用面谈和电话相结合的方式进行跟踪随访，随访内容包括病情变化、年发作频次、用药情况以及疗效等，每年随访4次以上，随访3年以上诊断仍未变更者纳入本研究病例组。

1.2.2 DNA样本采集 所有受试者入组后采集静脉血5 mL于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，-70℃保存待测。使用TIANGEN公司的DP348-3全血基因组DNA纯化试剂盒成批提取受试者DNA，于-20℃中保存。

1.2.3 tagSNPs筛选及检测 根据NCBI和NHGRI联合构建的dbSNP数据库（Hapmap Data Rel28PhaseⅡ+Ⅲ，August10，onNCBI B36 assembly，dbSNPb126-CHB+JPT数据）初步选择tagSNPs位点，设置条件为r2＞0.8，最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）＞0.001，最终选择 5-HTR1A（rs878567） 和 5-HTR2A（rs1328683、rs17068986、rs9534495）的4个 tagSNPs。在 384孔板中用Sequenom质谱分析（北京京虹汇盛科技有限公司质谱仪）进行tagSNPs位点基因分型检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0对一般资料进行统计分析，使用检验进行Hardy-Weinberg平衡（H-W平衡）检验。利用SHEsis软件，采用检验对基因型和等位基因频率分布进行组间比较，计算比值比（odds ratio，OR）和95%可信区间（confidence intervals，CI）。采用 SNPstats 软件，使用非条件logistic回归分析单位点基因型与疾病关联，根据阿凯克信息准则 （Akaike information criteria，AIC）选择最佳模型，即AIC值越小模型越准确，统计结果均采用Bonferroni校正，检验水准α=0.0125（0.05/4）。采用广义多因子降维法（generalized multifactor dimensionality reduction，GMDR）BetaV0.7软件包分析基因—基因交互作用。校正年龄和性别两个协变量后，基于交叉验证一致性和检验精确度选择最佳基因—基因交互模型。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 社会人口学资料及临床特征 病例组1030例患者，男性 422例（41.0%），女性 608例（59.0%）；年龄 18～65 岁，平均（39.1±13.6）岁；已婚 793 例（77.0%），未婚（含离异和丧偶）237 例（23.0%）；有工作 600例（58.3%），无工作 430例（41.7%）；高中及以下教育程度732例 （71.1%），本科及以上298例（28.9%）。对照组851名健康体检者，男性468名（55.0%），女性 383名（45.0%）；年龄 18～65岁，平均（35.9±12.9）岁；已婚 630 名（74.0%），未婚 221名（26.0%）；有工作 470名（55.2%），无工作381名 （44.8%）；高中及以下教育程度600名（70.5%），本科及以上 251名（29.5%）。病例组和对照组性别构成具有统计学差异 （=36.761，P＜0.001），其他资料组间差异均无统计学意义 （P＞0.05）。病例组初入组时 HAMD-24总分 （28.9±8.5）分；至本研究随访截点，病例组发作次数2～9次，中位数（上下四分位数）为 3（2，5）次。

2.2 H-W平衡检验 病例组和对照组4个tagSNPs的基因型和等位基因分布均符合H-W平衡定律（P＞0.05）。

2.3 基因型及等位基因频率分布 病例组与对照组比较，5-HTR2A rs17068986基因型 （=8.727，P=0.013）及等位基因（=4.955，P=0.025）频率分布差异均具有统计学意义，病例组T等位基因频率高于对照组（OR=1.158，95%CI:1.018～1.318）。其他tagSNPs（rs878567、rs1328683、rs9534495）基因型及等位基因频率在两组间分布差异均无统计学意义（P＞0.05）（表 1）。

2.4 4个tagSNPs在不同遗传模型中基因型分布5-HTR2A rs17068986基因型分布符合共显性 （P=0.011，AIC=2519.7）、显性（P=0.003，AIC=2517.9）和加性（P=0.036，AIC=2522.3）遗传模型，其中显性遗传模型为最佳模型（AIC值最小），经Bonferroni校正，该模型中基因型分布差异仍具有统计学意义（P＜0.0125），该模型中病例组TT+TC基因型频率高于对照组 （81.0%vs.75.4%，OR=1.410，95%CI:1.120～1.760）。其他 tagSNPs（rs878567、rs1328683、rs9534495）在不同遗传模型中的基因型分布均无统计学意义（P＞0.05）（表 2）。

2.5 5-HTR1A与5-HTR2A基因交互作用 校正性别和年龄后，GMDR结果显示一阶、三阶和四阶模型均具有统计学意义（P＜0.05）。比较交叉验证一致性及检验精确度，四阶模型为最优模型，该模型经过1000次置换检验具有统计学意义（P=0.001），交叉验证一致性为10/10，检验精确度为0.534。二阶模型无统计学意义 （1000次置换检验P＞0.05）（表 3）。

表1 病例组与对照组基因型及等位基因频率分布

表2 4个tagSNPs在不同遗传模型中的基因型分布

3 讨论

本研究发现，5-HTR2A rs17068986位点等位基因频率及基因型分布在两组间存在统计学差异，TT+TC基因型携带者相对于CC基因型携带者患病风险增加（OR=1.410），提示该位点可能为中国汉族RMDD患者的易感基因位点。全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）证实抑郁症与精神分裂症具有共同的遗传风险背景[12]，BANI-FATEMI等[13]发现 rs17068986 位点与精神分裂症患者自杀企图密切相关，推测该位点与抑郁症也可能存在关联。rs17068986位于13号染色体，属于内含子区域的tagSNP。tagSNPs是在高度连锁不平衡的基因组区域中具有代表性的SNPs，可代表其所在单体型区域的单体型（haplotype）信息。既往多项研究发现5-HTR2A基因的rs7997012位点与抑郁症相关[14]，而rs17068986位点与该位点仅相距4 kb的距离，因此rs17068986位点极有可能连锁该致病位点，在5-HTR2A基因的表达路径上发挥一定作用，进而增加RMDD的易感风险。目前国内外尚无其他关于RMDD与rs17068986位点的研究，因此该位点研究结果的可复制性及功能意义需要后续研究进一步证实。

表3 5-HTR1A与5-HTR2A基因交互模型

一项包括日本人、白种人、德国人和意大利人的大样本meta分析显示5-HTR1A的rs878567位点与抑郁症有关[15]，有研究显示rs6295与抑郁症发病有关，且rs878567与rs6295之间存在强连锁不平衡[16]。国内一项针对汉族人群5-HTR1A基因rs878567位点的研究则未见其与抑郁症存在关联[17]。本研究再次在中国汉族人群中探讨rs878567、rs1328683和rs9534495与RMDD的关系，仍未找到关联的证据，提示除种族因素外，不同的诊断亚型可能也是影响因素之一。rs878567位点位于5-HTR1A基因的3′非翻译区，与rs6295位点仅相距2 kb距离，可能同属一个单倍型，但本研究的关联分析结果未能证实其与RMDD有关，推测与其遗传效应过低有关。

抑郁症属多基因遗传病，多个微效基因作用叠加是目前公认的假说[18]，5-HTR1A和5-HTR2A基因也存在相互影响[19]。GMDR是目前分子遗传领域常用的数据处理方法，可以获得两个以上基因是否存在交互作用的数据信息[20]。本研究采用GMDR方法发现，校正性别、年龄后，5-HTR1A（rs87856） 和 5-HTR2A （rs1328683、rs17068986、rs9534495）基因存在交互作用，提示5-HTR1A和5-HTR2A基因突变可产生交互作用，增加个体的RMDD易感风险。“5-HT受体不平衡假说”认为5-HTR1A和5-HTR2A的效应相互影响或相互拮抗，目前国内外研究也验证了这一假说[21-22]，因此5-HTR1A和5-HTR2A基因交互作用对RMDD的影响从生物学角度也可以解释。

本研究以RMDD患者为研究对象，目的是尽可能排除亚组异质性，但仍不能完全排除其他亚型的患者，例如伴精神病性症状的抑郁症患者。另外，SNP只是点突变，是否影响下游蛋白表达，以及其与其他低频突变或罕见变异的关系等，均需后续研究加以证实。

致谢：衷心感谢新乡医学院第二附属医院王新友主任及河南科技学院校医院何茶叶院长在前期样本收集过程中提供的帮助。