鸽源奇异变形杆菌中磷霉素耐药基因fosA 3的流行与传播特征

路佳琦,张荣民,程 珂,何 冰,廖晓萍,孙 坚,刘雅红,方亮星 (华南农业大学 兽医学院 国家兽医

微生物耐药性风险评估实验室/广东省兽药研制与安全评价重点实验室,广东 广州510642)

奇异变形杆菌属于肠杆菌科,为革兰阴性菌,菌体无芽孢和荚膜、有鞭毛和菌毛,其广泛分布于人和动物肠道、动物粪便及临床标本,是导致人和动物感染的重要条件致病菌[1-2]。临床上针对奇异变形杆菌引起的感染性疾病多采用抗生素治疗,但由于抗生素的大量使用,不断有新的耐药菌株出现,给奇异变形杆菌感染的治疗带来了极大挑战。

磷霉素于1969年首次发现,是通过培养土壤链霉菌获得的天然广谱抗生素[3],用于治疗非并发性尿路感染[4-6]和多种混合感染[3,7]。随着耐药性问题日益严重,由于磷霉素对多重耐药革兰阴性菌具有良好抗菌活性,且仍然具有较低的耐药率,在许多国家重新引起人们的重视。磷霉素与磷酸烯醇式丙酮酸的分子结构相似,因而可以竞争细菌转移酶干扰细菌细胞壁的合成从而起到杀菌作用[8],而细菌对磷霉素的主要耐药机制是通过染色体编码而不是质粒的水平传播[9-11]。然而,随着日本学者在产CTXM 大肠杆菌中发现质粒介导的磷霉素耐药基因fosA3[12],该基因已成为我国肠杆菌尤其是大肠杆菌中最为流行的质粒介导的磷霉素耐药基因[13]。

尽管磷霉素在我国没有批准用于动物,然而在食品动物源肠杆菌尤其是大肠杆菌出现磷霉素耐药菌,fosA3是介导其耐药的主要机制[14-15]。在中国,肠杆菌科细菌中抗生素的高耐药率在各种食源动物中被频繁报道,食源动物被认为是携带各种抗生素耐药基因的载体[16-17]。在中国、西欧和东南亚的一些国家,鸽子通常被视为食源动物,对抗菌药物的使用有所限制[18],因而,鸽子也被认为是耐药革兰阴性菌的潜在储存库。本研究旨在调查鸽源奇异变形杆菌中质粒介导的磷霉素耐药基因流行情况及传播特征,以期为控制禽源多重耐药奇异变形杆菌的传播提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源从广东省佛山市某鸽场共采集72份样品,采集对象为鸽子及周围环境,包括健康鸽子粪便40份、病死鸽盲肠内容物9份及心包液7份、鸽子舍周围污水10份、灰尘4份及苍蝇2份。

1.2 标准菌株沙门菌Braenderup血清型PFGE Marker H9812,E.coliC600,E.coliATCC25922,均为实验室保存。

1.3 培养基、主要抗菌药物及试剂MH 琼脂(Luria-Bertani agar)、麦康凯琼脂(MacConkey agar)、LB肉汤(Luria-Bertani broth)及MH 肉汤(Muller-Hinton broth)均购于广州环凯微生物有限公司；氨苄西林(ampicillin,AMP),头孢噻肟(cefotaxime,CTX),阿米卡星(amikacin,AMK),硫酸庆大霉素(gentamicins,GEN),硫酸链霉素(streptomycin,STR),磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole,SMZ),甲氧苄啶(trimethoprim,TMP),盐酸四环素(tetracycline,TET),盐酸环丙沙星(ciprofloxacin,CIP),氯霉素(chloramphenicol,CHL),氟苯尼考(florfenicol,FFC),硫酸黏菌素(colistin sulphate,CS),替加环素(tigecycline,TIG),美罗培南(meropenem,MEM),磷霉素(fosfomvcin,FOS),购于源叶生物公司；6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphate)无水乙醇,70%甲酸,乙腈,1 mol/L Tris-HCl,0.5 mol/L EDTA,20%十二烷基磺酸钠溶液,10×TE Buffer,1×TE Buffer,细胞裂解液,蛋白酶K,0.5×TBE,市购。

1.4 细菌的分离、鉴定与磷霉素耐药基因的检测

样品的采集方法是用无菌棉签蘸取相应部位表面,再将棉签拭子放进提前准备好的90%生理盐水中,编号保存。用无菌棉签将生理盐水稀释液均匀涂布于麦康凯板并编号,37℃恒温培养12～16 h,挑取2～4个不同形态单菌落并保菌备用。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法对分离得到的细菌进行菌种鉴定。对分离到的奇异变形杆菌进行质粒介导的磷霉素耐药基因fosA3、fosC2以及fosA的检测,采用文献[19]已报道的引物,由广州擎科测序公司合成。

1.5 药敏试验采用微量肉汤稀释法测定奇异变形杆菌最小抑菌质量浓度,测定磷霉素时要中加入6-磷酸葡萄糖,浓度为25 mg/L,根据CLSI-2018和EUCAST-2018标准进行结果判断。

1.6 脉冲场凝胶电泳(PFGE)参照美国CDC Pulse Net的标准PFGE操作规程,并根据实际优化试验条件。奇异变形杆菌和标准菌株H9812制备的胶块分别用SfiⅠ和XbaⅠ进行酶切后,置于CHEF-DR Ⅲ System (Bio-Rad Laboratories,USA),在14℃,6 V/cm,2.2～54.2 s,19 h的条件下进行电泳,获取图像用Bio Numerics软件分析。

1.7 全基因组测序与核心基因组进化树分析挑取不同PFGE 谱型携带质粒介导磷霉素耐药基因的奇异变形杆菌,采用细菌基因组DNA 提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取其基因组DNA,送至北京诺禾致源生物科技股份有限公司测序；采用细菌全基因组PE150 策略,构建Illumina PE(350 bp)文库；利用Illumina平台测序,de novo组装后分析生物信息。从GenBank筛选不同地区、来源与采集时间的奇异变形杆菌与本研究中全基因组测序菌株构建核心基因组进化树。使用SPAdes拼接二代数据,Parsnp分析进化树,通过在线软件(http：//www.evolgenius.info/evolview/)对进化树进行标注和美化。

1.8 接合转移试验与I-CeuⅠPFGE 和Southern杂交接合转移试验通过滤膜接合法,将fosA3阳性奇异变形杆菌作为供体菌,标准菌株E.coliC600作为受体菌,在含有256 mg/L 磷霉素和200 mg/L链霉素的麦康凯板上挑选接合子,再通过PCR 与ERIC-PCR 进一步验证。I-CeuⅠPFGE 试验方法参考1.6方法,注意调整D值至1.8,待测菌小胶块用I-CeuⅠ酶37℃酶切3 h。Southern杂交按High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ试剂盒使用说明书操作,制作23S r RNA 和fosA3探针并分别进行杂交。

1.9 基因环境分析使用BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对分析序列,找到相应参考序列,设计并合成引物,采用PCR-mapping方法研究质粒介导的磷霉素耐药基因的基因环境,使用DNAStar系列软件和BLAST 进一步比较分析。

2 结果

2.1 细菌的分离、鉴定与质粒介导的磷霉素耐药基因的检出情况将鸽场采集的72份样品涂板培养,根据单菌落形态和革兰染色,从每个样本中挑选1～3个菌株,共获得151 株革兰阴性菌。通过MALDI-TOF-MS法进行菌种鉴定,结果共得到108株大肠杆菌,4株肺炎克雷伯菌,22株奇异变形杆菌,17株其他菌种。其中,不同来源样品奇异变形杆菌的检出率为0.0%～53.3%,病死鸽心包液中检出率最大(53.3%),总检出率为14.6%。20株奇异变形杆菌中有16株检出fos A3,fosC2以及fosA均无检出(表1)。

表1 细菌的分离、鉴定与奇异变形杆菌检出情况表 株

2.2 fosA 3阳性菌的药敏试验采用微量肉汤稀释法对16株fos A3阳性奇异变形杆菌进行13种抗生素的敏感性检测,结果(图1)显示,所有fosA3阳性菌株均对磷霉素耐药(MIC＞256 mg/L)；此外还对氨苄西林、头孢噻肟、四环素、替加环素、黏菌素、环丙沙星、氯霉素以及氟苯尼考等8种抗菌药物耐药。另外还有3株菌对庆大霉素耐药。然而所有fos A3阳性菌株均对磺胺类药物、阿米卡星及美罗培南3种药物敏感。

2.3 PFGE分型为鉴定本研究fosA3阳性奇异变形杆菌之间的亲缘关系,对16株fosA3阳性奇异变形杆菌进行PFGE 分型,所得结果(图1)应用Bio Numerics软件分析,将PFGE 谱型相似性大于80%的菌株视为同一克隆群,16株fosA3阳性奇异变形杆菌仅分为2个群,各包含8株菌。结果表明,鸽场内fosA3阳性奇异变形杆菌存在克隆传播现象。

图1 16株fosA 3阳性奇异变形杆菌PFGE分型、菌株来源和耐药表型

2.4 全基因组测序与核心基因组进化树截至目前,GenBank上已经上传了144株奇异变形杆菌的全基因组数据,包括从医院病人来源的菌株有85株,动物源6株,环境源3株以及剩余未知来源50株。通过比对分析,仅发现3 株fosA3 阳性菌株

(ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenBank/bacteria/Proteus_mirabilis/)。为了分析本研究fos A3阳性奇异变形杆菌和GenBank数据库中奇异变形杆菌的亲缘关系,从本研究16株fosA3 阳性奇异变形杆菌的2个PFGE谱型中各挑选1株菌进行全基因组测序,再从144株菌中随机挑选出不同地区、来源以及采集时间的菌株共35株,包括3株fosA3阳性以及32株fosA3阴性菌株(表2)。本研究通过Parsnp软件比对上述获得37株菌的全基因组序列,删除重排或插入序列,获得这37株菌的核心基因组；经分析发现共包含76 182个SNPs,再根据核心基因组SNPs构建这37株菌的进化树。结果可分为2个分支(图2)：第1个分支包含9株菌,菌株来源于亚洲、欧洲和北美洲,包括人和动物；第2个分支包含28株菌,菌株来源于五大洲,包括动物、环境和人。值得注意的是GenBank下载的3株人源fosA3阳性奇异变形杆菌核心基因组仅有2 124 个SNPs,本研究发现的动物源奇异变形杆菌(X4-2)和其中1株人源菌株(SAMN03154481)共有5 283个SNPs。

2.5 接合转移试验与I-CeuⅠPFGE 和Southern杂交

2.5.1 接合转移试验 16株fosA3阳性奇异变形杆菌作为供体菌,标准菌株E.coliC600 作为受体菌,通过滤膜接合方法进行接合转移,多次尝试,均未成功,表明fosA3基因可能位于不可接合型质粒上或染色体上。

表2 核心基因组进化树菌株信息

图2 37株奇异变形杆菌核心基因组分析

2.5.2 I-CeuⅠPFGE 和Southern杂交 为了进一步对阳性菌株中fosA3 基因进行定位,选取不同PFGE谱型的2株fosA3阳性奇异变形杆菌,对其染色体进行I-CeuⅠ酶切,通过PFGE 电泳后分别与23S r RNA 和fosA3 探针杂交确定基因位置。Southern杂交结果显示出杂交条带,表明fosA3定位在奇异变形杆菌的染色体上(图3)。

图3 奇异变形杆菌中fosA 3基因定位 A.I-CeuⅠPFGE；B.23S r RNA 杂交；C.fosA 3杂交。M.H9812 Marker；1.菌株X4-2；2.菌株X1-3-1

2.6 fosA 3基因环境分析通过PCR-mapping的方法,分析2株不同PFGE 谱型菌株中fosA3基因环境,结果显示,所有阳性菌株中均检测到IS26-orf3-Δorf2-orf1-fosA3-IS26 的 遗 传 结 构,fosA3基因上下游各有一个插入元件IS26,暗示其在fosA3的转移中起着重要作用(图4)。将获得的fosA3基因环境序列在GenBank数据库进行BLAST比对,发现17条序列(表3)与本研究fosA3基因环境完全相同,均含有IS26-orf3-Δorf2-orf1-fosA3-IS26的遗传结构,这17条核酸序列来源于大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌及沙门菌中,菌株样品来源广泛,包括人、猪、鸡、鸭、鸟及食物等。

图4 奇异变形杆菌中fosA 3基因环境

表3 GenBank中与奇异变形杆菌fosA 3基因环境相同菌株

3 讨论

自2010年WACHINO 等[12]首次在大肠杆菌中发现质粒介导的磷霉素耐药基因fosA3后,国内外不断有fosA3基因检出的报道,但关于奇异变形杆菌中fosA3基因检出情况的报道很少。2017年HE等[20]在患病鸡组织中分离得到7株fos A3阳性奇异变形杆菌,检出率为16.3%,并首次报道了fosA3和CTX-M 基因一起整合到奇异变形杆菌染色体上；2018年LEI等[21]从中国四川省腹泻猪粪便拭子中分离得到的1株fos A3阳性奇异变形杆；2018年MAEYAMA 等[22]从487株猫和狗的尿道临床分离株中分离得到56株奇异变形杆菌,但未检测到fosA3基因。本研究对广东省佛山市某鸽场采集的72份样品中分离到的151株革兰阴性菌进行了磷霉素耐药基因的调查,检测到16 株fosA3阳性奇异变形杆菌,检出率为14.6%,与HE 等[20]研究中fosA3阳性奇异变形杆检出率相近。本研究报道鸽子携带fosA3阳性奇异变形杆菌,鸽子具有较强的迁徙能力,可对公共卫生造成严重威胁。

质粒介导的磷霉素耐药基因fosA3 主要存在于肠杆菌科的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌,且常与blaCTX-M、rmtB等耐药基因在不同的质粒上发生水平转移[12]。目前,我国动物源肠杆菌尤其是大肠杆菌中主要是通过FII型及HI2 型质粒介导fosA3传播,且插入元件IS26在介导该基因的传播上起到重要作用[23]。然而,本研究中fosA3均位于奇异变形杆菌染色体上,主要通过菌株的克隆传播介导fosA3在鸽场不同来源包括鸽子、污水和苍蝇等之间传播。通过进一步对奇异变形杆菌染色体上的fos A3基因环境进行分析,发现该基因位于插入序列IS26介导的复合转座结构中。通过比较本研究获得的fosA3基因环境与GenBank数据库,发现该复合转座结构首次在2010年中国台湾地区的人源样品的克雷伯菌属中发现[24],并且在不同种属细菌染色体(CP029242)和质粒[25]上均有存在,表明IS26介导的复合转座结构在介导fos A3的散播上起重要作用。

核心基因组进化树显示,菌株在2个簇中地理和宿主来源大致相同,表明这这些菌株并未在某一地区形成单独进化族群,推测奇异变形杆菌在不同地区进化进程相似。在5株fosA3阳性奇异变形杆菌中,3 株人源的SNP 较另外2 株(1 株人源,1株鸽源)少,表明fosA3阳性奇异变形杆菌在相同宿主中亲缘关系较近。在建树的37株奇异变形杆菌中,本研究的1株fosA3阳性奇异变形杆菌(X4-2)仅与1株人源菌株亲缘关系最近,推测这株菌可能在人和动物中相互传播。

本研究调查了鸽源奇异变形杆菌中磷霉素耐药基因fosA3的流行与传播特征,发现奇异变形杆菌中fosA3 存在较高的流行性,且主要位于染色体上。fosA3基因主要通过菌株的克隆传播在多种来源样品之间进行传播。此外,IS26-fosA3-IS26 组成的复合转座结构很可能介导该基因在不同肠杆菌的质粒和染色体之间转移,从而加速fosA3 的散播。