我国10株猪细小病毒7型全基因组遗传与重组分析

张 志,张丽丽,2,刘 爽,董雅琴,张 慧,张 峰,崔 进,吴发兴,李晓成∗ (.中国动物卫生

与流行病学中心,山东 青岛266032；2.青岛农业大学,山东 青岛266019)

细小病毒科(Parvoviridae)是一类单股非囊膜线性DNA 病毒,体积较小,直径只有18～26 nm。在自然界中分布广泛,感染宿主种类多样。根据感染宿主的不同又将细小病毒科分为细小病毒亚科(Parvovirinae)和浓病毒亚科(Densovirinae),前者感染脊椎动物,而后者感染节肢动物[1]。细小病毒亚科的病毒种类繁多、感染宿主广泛,主要包括猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、牛细小病毒、犬细小病毒、猫细小病毒、鼠细小病毒等以及阿留申水貂病病毒、猫白血病减少症病毒等。PPV 的基因组大小为4.0～6.3 kb,由5′端UTR、非结构蛋白(NS1)、结构蛋白(Cap)和3′端UTR 组成[2]。它主要引起猪的木乃伊胎、不孕不育、早期胚胎死亡、死胎等繁殖障碍症状,是影响养猪业的重要病原之一。数十年来,随着PPV 疫苗的普遍应用,PPV 病的危害逐渐减轻,多呈散发和零星发生[3]。但是,近年来,随着检测技术水平的提高和新型检测技术的运用,又陆续从猪体内发现和鉴定了6种不同的细小病毒(PPV2-7)[4-9]。2013年,根据细小病毒的分子遗传演化特征,国际病毒分类专业委员会(ICTV)重新对细小病毒进行了分类,将细小病毒亚科调整为8个属,这些PPV 分别属于3 个细小病毒属[1]。2016年,PALINSKI等[9]首次从美国健康猪的棉拭子中通过基因组测序发现新的PPV,它与细小病毒其他属的同源性较低,其病毒的ORF与狐蝠细小病毒2和火鸡细小病毒TP1-2012/HUN 毒株的同源分别为42.4%和37.9%,因此作者把这个新的PPV命名为PPV-7,并把这3种病毒归为一个新的病毒属Chapparvovirus。2017 年,我国XING 等[10]首次从广东某2 个商品代猪场的猪血清中检测到PPV-7的DNA,证实我国猪场也存在PPV-7感染。本实验室的前期工作已经建立了PPV-7的荧光定量PCR 检测方法[11],在此基础上进一步对检测到的阳性样品进行全基因组测序和遗传演化分析,以获得我国猪群PPV-7流行毒株的分子流行病学特征。

1 材料与方法

1.1 样品来源10份PPV-7阳性猪组织样品,编号：JL1、JX52、SC86、SCF73、SD170、SD173、XJ35、YN3,分别采自福建、山东、河南等省份的猪群,由本实验室检测、鉴定和保存。

1.2 主要试剂Premix Ex-Taq 酶、p MD18-T vector

和DH5α感受态细胞为宝生物工程(大连)有限公司产品；病毒DNA提取试剂盒(DNAZol)、DMEM 培养基、胎牛血清、胰酶等为Life公司产品。

1.3 引物设计以PPV-7毒株KU563733的序列为参考模板设计全基因组的扩增引物,详见表1。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

表1 引物序列与扩增产物大小

1.4 PPV-7阳性模板的提取根据DNAZol说明书操作,即将PPV-7 阳性样品研磨后取上清液0.25 m L 加入DNAZol 0.75 m L,混匀后室温静置3 min,然后加入0.5 m L无水乙醇,12 000 r/min离心6 min,弃去上清液,加入1 m L 70%的乙醇洗涤1次,再次以12 000 r/min离心6 min,沉淀干燥后用50μL的dd H2O 溶解作为模板备用。

1.5 PPV-7全基因组扩增以上述提取的DNA 为模板,分别用设计的4对PPV-7全基因组引物进行PCR扩增。PCR的反应体系：25μL 2×Premix,上游引物和下游引物(20μmol/L)各1μL,2μL样品DNA模板,加水至50μL。PCR 的反应程序：95℃预变性3 min,33 个 扩 增 循 环(95℃30 s、55℃45 s,72℃60 s),72℃10 min,然后电泳观察扩增结果。

1.6 测序和测序结果分析将PCR 扩增的阳性PCR产物与p MD18-T 载体连接,并转化DH5α感受态细胞,提取质粒进行鉴定,然后挑选阳性克隆送宝生物工程有限公司进行测序。选择GenBank中已登录的PPV1-7型毒株和其他同亚科的细小病毒毒株作为参考毒株进行序列分析(表2),利用DNAStar和CLUSTALW1.83 等软件进行核苷酸序列比对、同源性分析；利用MEGA7软件构建系统进化树,并以Bootstrap 值1 000验证进化树的可信度[12]；利用RDP4软件进行病毒重组分析[13]。

2 结果

2.1 PPV-7分段PCR 扩增结果分别用表1的4对引物对10份阳性的PPV-7病料为模板进行PCR扩增,4对引物均可以扩增出特异性的与目的基因相符合的条带,如图1所示。

2.2 PPV-7全基因组同源性分析10份PPV-7毒株与PPV1-6等不同毒株的同源性较低,分别只有32.4%～33.1%,31.4%～32.1%,32.7%～32.5%,31.8%～32.4%,31.0%～31.4%,29.4%～29.7%；与同属的鸡细小病毒2(MG846442)、小鼠细小病毒(MF175078)和田鼠细小病毒2(KX272741)的同源性分别为46.1%～46.8%,50.1%～50.8%,48.5%～49.6%；与PPV-7参考毒株KU563733的同源性最高,为92.2%～95.9%。

2.3 PPV-7的进化树分析结果进一步用MEGA7对10个PPV-7流行毒株进行遗传进化树分析,发现这10个流行毒株与5个PPV-7参考毒株同处一个进化分支,其次与同一病毒属的MG846442、KX272741、MF175078 等参考毒株遗传关系较近,均属于Chapparvorirus病毒属。另外,从进化树上还可以看出,Amdoparvovirus等同属于细小病毒亚科的8个病毒属也各自形成自己的进化分支,与同源性的分析结果一致。详见图2。

图1 用PPV-7的4对引物扩增样品JL1株的PCR 结果 M.DL2000 DNA Marker；1～4.4对不同引物扩增的结果

图2 不同细小病毒的进化树分析(ML法)

2.4 PPV-7基因重组分析分别利用RDP4软件中的RDP(G)、GENECONV(G)、BootScan(B)、MaxChi(M)、Chimaera(C)、SiScan(S)和3Seq(T)等7种运行程序对10 株PPV-7 流行毒株和4 株PPV-7参考毒株进行病毒基因组重组分析,结果显示,10株流行毒株均有发生重组的现象,其中SD47等毒株有6种方法可以检测到重组事件的发生,详见表3和图3。另外,从图3中可以看出,流行毒株XJ35的重组病毒来自两个父本毒株MG543469和JX52,其中主要重组区域为2 712～3 610,重组发生在XJ35和MG543469之间,其次重组发生在JX52和XJ35之间。

表3 RDP4软件中6种程序检测的PPV-7基因重组结果

图3 XJ35流行毒株的重组检测结果(Distance Plot方法显示)

进一步分析这10株PPV-7流行毒株的重组位点和重组父系毒株可以看出,PPV-7流行毒株的重组位点呈现多样性,重组的父系毒株也不尽相同,详见图4。

图4 PPV-7流行毒株的不同重组位点和父系毒株

3 讨论

PPV-7是近年新发现的一种感染猪的细小病毒亚型。由于目前的研究资料较少,其基因组变异状况和病毒的致病性尚不清楚。试验通过对我国目前数个省份鉴定的PPV-7阳性病料进行PPV-7的全基因组序列鉴定和分析,有助于进一步认识和了解PPV-7的基因组特征。结果显示,这10 株PPV-7的全基因组核苷酸序列与美国、巴西以及我国以前的PPV-7流行毒株的同源性为92.2%～95.9%,表明这些流行毒株相对比较稳定。

近年来,随着高通量测序技术和宏病毒学的快速发展,人和动物体内不断有新的病原被发现,从而不断打破原有的病毒分类方式。目前细小病毒亚科分为Prothoparvovirus等8个属,而PPV-7的分类地位尚无定论。尽管PALINSKI等[9]建议将PPV-7与狐蝠细小病毒2 和火鸡细小病毒TP1-2012/HUN 毒株等归为一个新的病毒属Chapparvovirus,但这一分类并没有得到广泛认同。究其原因,主要在于PPV-7与狐蝠细小病毒2和火鸡细小病毒TP1-2012/HUN 毒株的同源性分别只有42.44%和37.90%,同时与Protoparvovirus属的HK-2014的同源性只有34.33%。本研究结果也进一步表明,PPV-7 与Chapparvovirus属 的3 个 参 考 毒 株(MG846442、MF175078和FX272741)的同源性只有46.1%～50.8%,与其他PPV1-6的同源性只有30%左右,考虑到病毒宿主的差异性,作者认为应该把PPV-7独立出来成立一个新的病毒属,而Chapparvovirus属的3个参考毒株与狐蝠细小病毒2和火鸡细小病毒仍属于原来的病毒属Chapparvovirus。

尽管DNA 病毒相对RNA 病毒的变异性稍小,但这些PPV-7 毒株形成的分子进化树也显示,PPV-7内部的分化趋势已经比较明显。10个PPV-7流行毒株与参考毒株均不在同一个进化分支,而是形成4个比较小的进化分支。同时,利用RDP4软件的分析结果也显示,PPV-7流行毒株的重组位点呈现多样性,重组的父系毒株也不尽相同。这些结果都表明PPV-7 一直处于不断的变异中,而且PPV-7还没有形成占主导地位的优势分支,这也意味着目前的猪体对PPV-7的选择压力不大。现尚不得而知这种不断的变异将来对猪产生何种致病性,但至少已经提醒我们必须要关注目前PPV-7的感染和流行情况。