奶牛乳汁外泌体中乳房炎抗性相关microRNA的筛选与功能分析

王宇轩,韩 硕,杨卓妮娜,邹紫雯,刘 娟,赵志辉,沈冰蕾∗ (.黑龙江八一农垦大学 动物科技学院,黑龙江 大庆6339；.广东海洋大学 农学院,广东 湛江54088)

miRNA 是一种长度约为22 bp,高度保守的非编码单链RNA,通过与目标m RNA 的3′UTR 区域完全或不完全靶向结合,便可调控基因的表达[1]。不完全结合可抑制翻译的进行,完全结合可使mRNA 降解,属于转录后调控的重要成分。并有新的研究揭示了miRNA 可与其他功能蛋白相结合和可直接激活TLR 受体蛋白等7种非经典分子机制[2]。但无论何种作用机制,均证实单个miRNA 能结合调控多个靶mRNA,mRNA 的表达也受多个miRNA 的综合调控。而机体的免疫系统具有免疫监视、防御和调控等作用,miRNA 不可避免地参与其中。如miR-221[3]、miR-146a[4]、miR-203[5]、miR-125b[6]等在炎症发生过程中发挥突出作用；此外miRNA 在参与乳腺疾病的发生和发展,同时对其临床诊断、治疗以及乳腺癌的预后等有重要意义。

外泌体是一种介于40 ～100 nm 的小囊泡,在细胞间的信息传递中起着重要的作用[7]。人体内多种细胞都可分泌外泌体,包括血小板、内皮细胞、肥大细胞、树突细胞、成纤维细胞、间充质干细胞和肿瘤细胞等[8],但不同的细胞分泌的外泌体亚型有区别。外泌体天然存在于大多数体液中,包括血液、唾液、尿液、脑脊液和母乳等,其核酸组分有DNA、m RNA、miRNA、lncRNA 等。miRNA 是外泌体内最主要的RNA 组分,外泌体可通过转运miRNA 参与受体细胞基因转录后调控,影响受体细胞的生物学功能[9]。外泌体源性miRNA 的种类及数量变化可能与肿瘤的大小、恶性程度、侵袭转移、分期分级密切相关。外泌体通过转运具有侵袭潜能的miRNA,提高肿瘤的侵袭性。奶牛乳汁外泌体中也存在大量miRNA,且有待被陆续发现。其意义不仅可影响自身乳房健康,还可通过乳汁影响犊牛或奶制品食用者的免疫机能。牛奶等奶制品是维持人体健康的良好营养来源。牛奶还含有大量的生物成分,包括细胞因子、趋化因子和激素等。牛奶外泌体的miRNA 含量水平可能表明哺乳动物的健康状况,特定miRNA 的存在与否可以作为早期检测乳腺炎细菌感染的生物标志物[10]。并有研究表明牛奶中的miRNA 可通过外泌体调控人类基因的表达及功能发挥[11]。

基于此,本研究以健康奶牛及乳房炎奶牛乳腺组织差异表达的miRNA 为依据,通过生物信息学分析方法,筛选可能存在于乳汁外泌体中的miRNA,进而对筛选获得差异表达miRNA 的候选靶基因及其可能参与的与乳房炎抗性相关的调控功能进行预测与分析,为奶牛乳房炎抗性相关调控因子的分子标记辅助选择奠定基础。也为乳汁影响犊牛免疫功能及乳汁外泌体中miRNA 跨物种影响机体健康的分子调控机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 相关数据库Targetscan(http：//www.targetscan.org/)、miRDB(http：//www.mirdb.org/)和miRanda(http：//www.microrna.org/)是miRNA 相关分析的常用数据库,三者通过不同的计算公式,利用miRNA 种子区匹配保守性位点预测候选靶基因,并可对所预测靶基因进行评分估计。

DAVID(http：//www.david.abcc.ncifcrf.gov/)数据库通过生物学分析,全面计算基因在疾病与代谢中的相关通路、蛋白质的互作关系等。

Vesiclepedia(http：//microvesicles.org/index.html)为收集不同囊泡分子的集合数据库,其中包含了独立研究的349 988 个蛋白、27 646 个m RNA、10 520个miRNA、639个脂质条目、41个不同物种。可通过根据物种、囊泡、分子和样品类型浏览和检索目的蛋白或核酸。

1.2 健康奶牛及乳房炎奶牛乳腺组织差异表达miRNA的鉴定研究前期,通过在相同饲养管理条件下,利用体细胞鉴定、细菌学鉴定及奶样PCR 鉴定3种方法,获得健康奶牛及金葡菌乳房炎奶牛各3头,屠宰获取乳腺组织后,提取组织总RNA,利用Solexa第2代高通量测序技术,构建健康奶牛及乳房炎奶牛的乳腺组织miRNA 表达谱,并通过差异分析,以获得2个文库差异表达的已知miRNA。

1.3 奶牛乳汁外泌体中miRNA的获取主要采用以下3种方法收集。首先通过Vesiclepedia数据库检索奶牛乳汁外泌体中存在的miRNA,然后参考IZUMI等[12]利用超速离心和微阵列分析方法鉴定获得的奶牛乳汁外泌体miRNA；同时参考SUN等[10]从对照组和感染金葡菌奶牛中纯化乳汁外泌体中提取并鉴定获得的miRNA。3个筛选结果求并集。

1.4 乳汁外泌体中与乳房炎抗性相关miRNA 筛选及靶基因分析

1.4.1 乳汁外泌体中乳房炎抗性相关miRNA 以前期健康奶牛及金葡菌乳房炎奶牛乳腺组织差异表达miRNA 为背景,与数据库及文献检索出奶牛乳汁外泌体中的miRNA 求交集,筛选牛奶乳汁外泌体中与可能参与乳房炎抗性的相关miRNA。

1.4.2 乳汁外泌体中与乳房炎抗性相关miRNA 序列保守性分析 获取各物种miRNA 的成熟序列,对其在牛、人类、猪、鼠、马、犬、黑猩猩、大猩猩、恒河猴等哺乳动物中的保守性进行序列对比分析。

1.4.3 奶牛乳汁外泌体中乳房炎抗性相关miRNA候选靶基因预测及功能分析 对鉴定得到的miRNA 进行靶基因预测,获得miRNA 与候选靶基因间的靶向对应关系。主要通过Targetscan、miRDB和miRandasan 3个生物信息学系统,根据miRNA 5′端的2～8位核苷酸几乎无一例外地与靶m RNA序列的3′-UTR(3′-非翻译区)完全互补的特性,同时结合miRNA 与靶基因形成二聚体的热力学稳定性和二级结构等限制条件进行靶基因预测。继而,利用DAVID 基因注释工具对分析得到的差异表达miRNA 的候选靶基因进行Gene Ontology与Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes分析,重点关注可参与炎症发生相关的免疫调控通路。

2 结果

2.1 健康奶牛与金葡菌乳房炎奶牛乳腺组织差异表达miRNA的鉴定经过表达谱差异分析,共筛选获得29个已知的差异表达miRNA,其中10个是表达上调,19个表达下调,结果见表1。

2.2 乳汁外泌体中与乳房炎抗性相关的miRNA

通过Vesiclepedia数据库与文献查找,共获得奶牛乳汁外泌体中miRNA 66个,其中筛选出3个在健康奶牛及乳房炎奶牛乳腺组织中差异表达的miRNA,分别是miR-223、miR-125b和miR-378b。

2.3 乳汁外泌体中与乳房炎相关miRNA 的序列保守性分析在Targetscan数据库中,通过对哺乳动物的miR-223、miR-125b 和miR-378b 进行比对,如：牛、人类、猪、鼠、马、犬、黑猩猩、大猩猩、恒河猴等,分析物种类间miRNA 的保守性,结果如表2所示,表明三者在各物种间均高度保守。

2.4 乳汁外泌体中与乳房炎抗性相关miRNA 候选靶基因的预测及功能分析通过Targetscan软件共预测获得miR-223候选靶基因366个,miR-125b候选靶基因849 个,miR-378b 候选靶基因2 317个。通过DAVID 数据库分析与miRNA 结合评分较高的前10 个靶基因的KEGG 通路,结果显示miR-223主要参与m TOR 信号通路、黏蛋白型O-聚糖的生物合成、病毒致癌作用等信号通路等(表3)。miR-125b靶基因的KEGG 通路主要为甘油磷脂代谢、病毒致癌作用、甘油磷脂代谢、癌症通路等(表4)。miR-378b 靶 基 因 的KEGG 通 路 主 要 为MAPK 通路、癌症通路、内吞作用、溶酶体等(表5)。

表1 健康奶牛及乳房炎奶牛乳腺组织差异表达的已知miRNA

表2 不同物种miR-223、miR-125b和miR-378b的成熟序列比较

表3 mIR-223主要靶基因及KEGG 信号通路

表4 miR-125b主要靶基因及KEGG 信号通路

3 讨论

基因组的非蛋白质编码区实际上组成了极为复杂的RNA 基因调控网络,miRNA 是其中备受关注的一员。miRNA 作为研究热点,被认为是高效的基因表达调控因子。异常表达的miRNA 影响细胞增殖、凋亡、分化、血管生成及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)等一系列生物学行为。尤其在肿瘤的演变中发挥着致癌基因或者抑癌基因的作用[13-16],包括肺癌、肝癌在内的各大癌症。而奶牛乳房炎抗性已有近60年的研究历史,已从mRNA 水平筛选出很多抗性因子,但调节基因的关键靶点及作用机制仍有待进一步研究挖掘。其中miRNA 不可避免地参与其中,已有研究揭示在HMGB1的3’UTR 存在一个新的SNP位点会改变HMGB1与bta-miR-223 的结合,从而影响奶牛体细胞的评分,这个新的基因型以及bta-miR-223 可用于奶牛乳房炎抗病育种的候选标记物[17]。包裹在乳腺组织外泌体中的miRNA 可能成为许多乳腺疾病新的分子标志物和有效的诊断标志物。本研究筛选出的乳汁外泌体中miR-223、miR-125b 和miR-378b在物种间高度保守,其靶基因KEGG 信号通路显示都与炎症、癌症的发生显著相关,因此深入探索乳腺组织外泌体miRNA 对乳腺疾病的研究、代谢的了解以及奶牛乳制品调控都具有重要意义。

表5 miR-378b主要靶基因及KEGG 信号通路

本研究筛选获得的bta-miR-223已发现其可参与各大组织的炎症反应,靶基因功能分析显示其参与了体内各大通路的调节。关于miR-223 在疾病中的研究已有报道,但定位于奶牛乳汁外泌体中的miR-223 如何参与机体的调控还鲜有报道。ZHU[18]等通过qRT-PCR、Westernblot、免疫组织化学、透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析等方法,证明巨噬细胞衍生的外泌体将miR-223 递送至卵巢癌细胞引发化疗耐药性。CHEN[19]等得出骨髓干细胞衍生的外泌体可以在自身免疫性肝炎的实验模型中保护肝损伤,其机制可能与外源性miR-223调节NLRP3和Caspase-1有关。此外,PU 等[20]在制备链球菌感染乳腺模型的基础上,构建模型组与健康组奶牛乳腺组织的miRNA 表达谱,结果显示,与健康组相比,miR-223 在模型组中也显著上调。可见miR-223可参与多种疾病包括奶牛乳房炎的发生及免疫调控过程。但其具体的分子作用机制及通过外泌体为载体作用的研究还有待更多的试验验证。

截至目前,miR-125b 相关研究主要涉及肝癌[21]、卵巢癌[22]等。YAO 等[23]通过生物信息学分析和荧光素酶报告分析曾表明miR-125b通过靶向BMPR1B调控牦牛卵巢GC细胞凋亡。JIA[24]采用LPS模拟小鼠软骨形成的ATDC5 细胞系炎性损伤,通过双荧光素酶活性测定评估miR-125b 对MIP-1α3′UTR 的靶向作用,通过Westernwlot评估miR-125b对MIP-1α表达的调节作用和对炎性损伤的潜在调节机制,得出miR-125b 可能在软骨细胞炎症损伤中发挥重要作用,miR-125b通过调节MIP-1α的表达来调控NF-κB 和JNK 信号通路,影响ATDC5细胞的炎症损伤。已有研究表明miR-125b可通过外泌体为载体调控生理和病理过程。ZHU 等[25]发现缺氧诱导的间充质干细胞衍生的外泌体通过miR-125b抑制心肌梗死细胞死亡促进心脏修复。

而miR-378b,已有研究表明其具有通过作用于靶基因调节皮肤的衰老[26]、与细胞迁移和侵袭密切相关[27]、对成骨的调节[28]、调控脂肪的形成[29]等作用。WANG 等[30]通过试验证明miR-378b通过抑制NKX3.1 表达促进角质形成细胞的分化,抑制miR-378b表达可以拮抗钙诱导的分化过程。miR-378b可作为表皮分化过程中重要的调控因子,并参与众多疾病反应。结合牛奶外泌体对miR-378b进行研究,将有助于揭示皮肤损伤、奶牛疾病、人类疾病的标记和修复过程的标志跟踪,推动miRNA 在创伤临床治疗中的进一步应用。

综上所述,奶牛乳汁外泌体中的miRNA 及其候选靶基因可参与癌症以及炎症的发展过程和相关通路。且除miR-223外,另外2种miRNA 在奶牛乳房炎抗性中的相关研究应用仍鲜有报道。因此本研究可为后期外泌体中的miRNA 及其候选靶基因调控奶牛乳腺疾病以及跨物种间免疫调控的影响因素及作用机制研究提供重要参考。