影响H1N1亚型猪流感病毒致病性与传播性的分子机制研究进展

施丽薇,顾 敏,2,3,刘秀梵,2,3∗ (.扬州大学 农业部畜禽传染病学重点开放实验室,江苏 扬州225009；2.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏 扬州225009；3.江苏省人兽共患病学重点实验室,江苏扬州225009)

1 猪流感概述

猪流感(swine influenza,SI)是由正黏病毒科A型流感病毒属的猪流感病毒(swine influenza virus,SIVs)引起的猪急性、热性、高度接触性呼吸道传染病。A 型流感病毒是有囊膜、分节段的负股RNA病毒,有8个基因片段,根据长度依次为PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS,至少编码10个蛋白。病毒囊膜表面存在HA 和NA 两种蛋白,根据抗原性将HA 分为H1-H18 共18 个亚型,NA 分为N1-N11共11 个 亚 型[1-2],PB2、PB1、PA 组 成 病 毒 的RNA 聚合酶,行使病毒RNA 的转录和复制功能；NP 蛋白为核蛋白；M 基因编码基质蛋白M1和离子通道蛋白M2；NS蛋白为非结构蛋白,包括NS1和NS2。目前全球流行的SIVs有H1N1、H1N2和H3N2 亚型,其中H1N1 SIVs根据HA 分为经典H1N1(Classical H1N1,CSH1N1)SIVs和欧亚类禽H1N1 (Eurasian avian-like H1N1,EAH1N1)SIVs。2009 年,CSH1N1 SIVs、EAH1N1 SIVs与三源重组 H3N2(triple-reassortant H3N2,TRS H3N2)病毒组合,重配产生pdm H1N1/2009,引发了始于墨西哥的流感大流行。

2 H1N1 SIVs流行病学现状

H1N1 SIVs分为CSH1N1 SIVs和EAH1N1 SIVs。CSH1N1 SIVs于1930 年在北美猪群中分离[3],研究显示1918 年西班牙大流感很可能是由CSH1N1 SIVs造成[4]。1976年,MYERS等[5]检测发现美国迪克斯堡至少500 人感染了CSH1N1 SIVs。1979年,比利时等地分离到EAH1N1 SIVs,其与CSH1N1 SIVs相比有明显的抗原优势。此后,EAH1N1 SIVs逐步替代CSH1N1 SIVs,成为猪群中的优势株[6]。然而,在1988 年,CSH1N1 SIVs与人流感H3N2病毒组合形成双重组体,该双重组体进一步与禽流感病毒重组,形成TRS H3N2。此后以上病毒继续重组衍生了H1N2,H1N1,H3N1 等三源重组SIVs(triple reassortant internal gene SIVs,TRIG SIVs)[7],见图1。2001年,EAH1N1 SIVs传入香港[8],之后在我国猪群普遍流行。2009 年,CSH1N1 SIVs、EAH1N1 SIVs与TRS H3N2病毒组合,形成pdm H1N1/2009,造成全球流感大流行[9]。我国内地pdm H1N1/2009最早于2009年在四川发生,并扩散到全国,此后逐渐平息。陈化兰等[10]2010－2013年的研究发现,我国猪群中主要流行的是EAH1N1 SIVs。2015年,从湖南省1名肺炎儿童分离到了重组的EAH1N1 SIVs,该病毒基因分别来自EAH1N1、pdm H1N1/2009病毒和CSH1N1 SIVs,在小鼠中表现出更高的传染性和毒力[11]。2018 年苏慧娟等[12]研究显示,我国主要流行的SIVs是H1N1 SIVs,其中主要为EAH1N1 SIVs。此外,PB2、PB1、PA、NP 来自pdm H1N1/2009病毒的EAH1N1 SIVs自2013年后增多,预测此后可能会出现更多新型重组EAH1N1 SIVs。

图1 SIVs不同进化谱系的发展 注：绿色.禽流感谱系；黄色.人流感谱系；淡粉和淡紫.SI谱系；CSH1N1.经典H1N1；EAH1N1.欧亚类禽H1N1；TRIG SIVs.三源重组SIVs

3 影响H1N1 SIVs致病性与传播性的关键氨基酸位点变异

3.1 表面糖蛋白流感病毒外部基因包括血凝素(hemagglutinin,HA)基因和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因,分别编码促进病毒入侵宿主细胞和新生病毒粒子释放的糖蛋白。

HA 蛋白是病毒囊膜纤突的主要成分,其功能是结合宿主唾液酸类受体,辅助病毒吸附细胞。病毒的传播性与唾液酸受体结合能力密切相关,唾液酸受体分为ɑ-2,6受体和ɑ-2,3受体,获得结合ɑ-2,6受体的能力是实现病毒在哺乳动物间有效传播的必要条件[13],而127,159,222,223,225,226位的氨基酸与H1N1病毒结合ɑ-2,6受体的能力紧密相关[14-20]。研究表明,225E 和225D 分别在EAH1N1 SIVs和CSH1N1 SIVs 的传播性中发挥重要作用[21]。陈化兰等[18]进一步发现,EAH1N1 SIVs的225E能显著改变病毒在豚鼠中的复制效率和传播性。此外,D187E、K211E 和S289N 可使病毒在雪貂中通过空气传播[22]。KOEL 等[23]研究显示153和156位氨基酸显著影响病毒复制,156位可能改变pdm H1N1/2009病毒的抗原性,224位氨基酸改变更利于病毒逃逸抗体。糖基化对蛋白质有修饰作用,HA 上糖基化位点的位置与数量决定了病毒抗原性、受体结合能力和致病力,在pdm H1N1/2009病毒HA 上增加糖基化位点142和177,可增强病毒毒力,减弱对中和抗体的敏感性[24],而119位改变可引导产生潜在的N-糖基化位点,可能导致抗原性改变[25]。S202T 位于HA 蛋白球状头部区域,可能间接影响病毒与宿主细胞的结合,在C57BL/6J小鼠中,该突变与NP-I133L、I373T 共同加重炎症反应。

NA 蛋白在病毒侵染末期通过催化宿主细胞表面唾液酸受体水解以协助新生病毒颗粒释放,在病毒的复制和传播过程中有重要作用[26]。目前,首选的抗流感药物是NA 抑制剂,包括扎那米韦、奥司他韦等。然而随着NA 抑制剂的广泛使用,已出现病毒突变产生耐药性的现象。已知与耐药性密切相关的 位 点 有E119D/G、I223V、S247N、H275Y 和N294S[27-33],其中S247N＋H275Y 双突变病毒有极高的奥司他韦抗性[31]。最新研究发现R152K 和R368K 使得病毒对3种NA 抑制剂具有耐药性表型[34]。此外,NA 活性位点和周围的残基突变也可改变病毒对NA 抑制剂的敏感性。例如,V116、I117、E119、Q136、D199和I223位点的变化与季节性流感和H5N1病毒对NA 抑制剂的敏感性降低有关[35-40]。INOUE等[41]还发现了新型NA 缺乏病毒,该病毒NA 基因减少了1 009 nt,缺乏酶域,使病毒对NA 抑制剂产生耐药性,但并不影响其感染细胞,这类病毒的传播可能对药物治疗造成威胁。

3.2 RNA 聚合酶相关蛋白流感病毒的RNA 聚合酶由PB2、PB1、PA 组成,行使病毒RNA 的转录和复制功能。

PB2亚基能识别细胞m RNA 的5′端帽结构,并具有3′→5′的核酸内切酶活性。研究显示PB2蛋白能够影响病毒宿主范围和致病力。在小鼠模型中,E158G 显著增强病毒复制和致病力,甚至研究发现E158G 对pdm H1N1/2009病毒RNA 复制和发病机制的影响要比PB2-E627K 大得多,推测E158G 可能在禽类PB2基因适应哺乳动物的过程中起重要作用[42]。BUSSEY 等[43]研究显示能增强聚合酶活性,促进病毒在哺乳动物细胞中生长,MA等[44]进一步发现271A 可弥补627E 降低病毒致病性的缺陷,可能有助于pdm H1N1/2009病毒的传播以及跨物种传播。此外,588I也增强了病毒聚合酶活性以及对小鼠的致病性[45]。627K 可增强病毒的复制和对小鼠的毒力,是毒株致病力增强的标志[44]。701 N 会增强病毒在小鼠体内的复制和致病性,是流感病毒可在哺乳动物中复制和传播的标志[46]。

PB1蛋白促使病毒m RNA 合成起始后逐渐延长。目前与PB1位点突变相关的研究较少。最近研究显示,T296R 增强了病毒复制和聚合酶活性,以及pdm H1N1/2009 病毒对小鼠的毒性[47]。A469T 也显著增强聚合酶活性,与NS1-N205K 和NEP-T48N 的组合被认为是病毒能够在豚鼠中传播的决定因素[48]。KOÇER 等[49]发现PB1的4个残基H15R、N23S、T27I和H75L,通过残基效应和宿主效应与小鼠的致病性相关。

PA 蛋白是一种磷酸化蛋白,其功能尚不清楚。仅有刘金华等[50]研究显示,A70V 和P224S参与了病毒的致死表型,在病毒复制和人群传播中有选择性优势,两者联合突变显著提高了病毒致死率,加重肺脏的病理变化。P224S位于核定位信号域,可能影响PA 在病毒感染细胞的细胞核中的运输和积累[51]。这些突变导致病毒致病性增强的机理仍需要进一步研究。

3.3 核蛋白NP 蛋白负责与病毒RNA 结合,形成核糖核蛋白复合物,同时参与复合物的入核、出核以及病毒复制,为诱导宿主细胞免疫应答的主要成分。DANZY 等[52]发现,3种(PB2-Q236H,E627K,NP-N309K)或2种(PB2-Q591K、NP-S50G)突变的最小组合,可使病毒在人类支气管上皮细胞有效生长,说明NP 蛋白与其他蛋白有协同作用。100 位氨基酸位于表面多氨基酸簇内,对人类Mx A GTP酶具有耐药性,V100I 有助于病毒在小鼠中复制[53]。此前,GÍRIA 等[54]已证实V100I是促进病毒在人与禽间传播的重要变化。I133L 和I373T 位于NP和PB2的结合域中[55],都能增强病毒对小鼠的致病性[53]。pdm H1N1/2009 病毒在小鼠肺部连续传代后适应宿主,出现NP-I353V 和其他蛋白突变,对小鼠的致死率达到100%[56]。此外,D375N大大增强A/California/04/09的毒力,可能改变宿主范围,特别是从鸟类到哺乳动物的改变[14]。

3.4 基质蛋白及离子通道蛋白病毒的第7节段编码基质蛋白M1和离子通道蛋白M2,组成病毒基质蛋白层,其中M2蛋白是烷胺类抗流感药物的靶点[26],目前针对M 蛋白的研究多与耐药性相关。研究显示,M2 的L26F、V27A、A30T、S31N、G34E这些位点只要有一个或以上的变异就会导致耐药毒株的出现[57]。CAMPBELL 等[58]发现,pdm H1N1/2009病毒的M 片段增强了神经氨酸酶活性,随着活性变化,M 片段可影响病毒粒子的形态和在豚鼠中的传播能力。

3.5 非结构蛋白NS蛋白是非结构蛋白,包括NS1和NS2,与RNA 出核和拮抗宿主抗病毒反应相关。NS1的S/T7L和E227G通过残基效应和宿主效应与病毒致病性相关[49]。I123V位于蛋白激酶结合位点,可能提高病毒表达[59],还可能增强病毒致病性,促进病毒适应人类[54]。病毒在小鼠中连续传代后获得适应性突变G159E,可增强病毒对小鼠的致病性[56]。NS1蛋白C-末端的4个残基是病毒的致病因子,有大量研究与其相关。研究显示KSEV 取代C-末端可以加重肺部形态学病变[60]。GSEI和EPEV 与病毒毒性相关,可促进病毒跨越物种屏障[61]。ESEV、EPEV可增强病毒对小鼠的毒力[62]。由此可见,C-末端残基与病毒致病性密切相关。

综上所述,猪呼吸道上皮存在2种唾液酸受体,是流感病毒的混合器,所以人/猪/禽流感病毒均可感染猪,且容易在猪体内重组或突变,进而改变病毒特性。值得注意的是,某些氨基酸位点改变会导致病毒致病性或传播性变化,使得H1N1 SIVs跨宿主传播成为可能。如表1所示,我们对H1N1 SIVs的氨基酸突变进行了分类总结。

4 总结

众所周知,流感病毒的生物学特性是由不同基因片段组合产生的多基因性状。我国H1N1 SIVs中存在多样性和复杂性,病毒常出现基因重组或突变,导致相应特性改变。例如,某些氨基酸替换或增减可能通过改变蛋白质功能以及蛋白质之间的相互作用,进而改变病毒的致病性和传播性。随着H1N1 SIVs不断进化,感染人的现象多有发生,我国对H1N1 SIVs的研究仍需深入,以了解和监测H1N1 SIVs的变异、传播和潜在危害。病毒的HA蛋白结合宿主唾液酸受体,辅助病毒吸附细胞,影响病毒宿主范围；NA 蛋白识别唾液酸残基,介导病毒进出细胞,影响病毒耐药性；PB2蛋白识别和切割宿主m RNA 5′端帽结构,影响病毒的宿主范围和致病力；NP蛋白是诱导宿主细胞免疫应答的主要成分,影响病毒的复制与毒力；NS1蛋白主要影响宿主免疫调控,提高病毒致病性。目前对于以上5种蛋白的研究较为深入,而对于其他蛋白包括PB1-F2、PA-X 等辅助蛋白的作用机制仍需进一步探讨,这方面的研究将成为研究H1N1 病毒致病性与传播性分子机制的新突破点。

表1 H1N1 SIVs关键氨基酸位点变异导致的生物学特性改变