广东省部分奶牛场芽囊原虫感染情况及亚型分析

王璐阳,曹乐天,王艳歌,崔朝辉,梁 楠,张龙现 (河南农业大学 牧医工程学院,河南 郑州450046)

芽囊原虫是一种常见的胃肠道寄生性原虫,可以感染人类及非人灵长类,偶蹄类和鸟类等多种动物[1]。芽囊原虫的感染通常伴随着其他人兽共患肠道寄生虫的感染,如隐孢子虫,贾第虫等,其已经被确认为是引起肠易激综合征(IBS)和恶心、腹泻等临床病症的重要病原体[2]。与其他肠道寄生虫类似,芽囊原虫更容易感染免疫功能缺陷或者低下的人群,如艾滋病患者或者癌症患者。报道显示,相比于与动物没有密切接触的人群来说,动物饲养员具有更高的感染风险[3]。芽囊原虫主要经过“粪—口”途径感染宿主,其感染在世界范围内均有报道,但其感染率在不同的地区具有显著的差异[4]。在一些发达国家,人芽囊原虫感染率为10%～15%,在一些欠发达地区,其感染率高达55%～70%[5]。

近些年来,随着分子生物学的发展,人们利用分子生物学技术对世界不同地区的人和动物中分离出的芽囊原虫基于核糖体小亚基(SSU r RNA)基因位点进行亚型鉴定,发现其在宿主体内表现出较高的遗传多样性[4]。目前已经报道的有17个芽囊原虫亚型(subtypes,STs),其中在人类中鉴定出的亚型有9种(ST1～ST9),在哺乳动物和鸟类中共鉴定出17种芽囊原虫基因亚型(ST1～ST17),其中8 种(ST1～ST8)被认定为存在潜在的人兽共患风险[4]。ST1～ST3常见于非人灵长类动物,ST1、ST5常见于偶蹄类动物,ST6、ST7 常见于鸟类,而ST10、ST14常见于奶牛[5]。在我国,1990 年首次发现芽囊原虫感染人类的病例,随后在广州地区非人灵长类动物体内也发现了芽囊原虫的感染[6]。研究表明,牛可以感染多种人兽共患芽囊原虫亚型。目前,在我国仅报道了黑龙江省奶牛芽囊原虫感染情况[7-8]。本研究旨在了解广州地区奶牛芽囊原虫的感染情况及亚型分布,对评估奶牛芽囊原虫的潜在人兽共患风险提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集2016年4月从广东省4个奶牛场或养殖基地共采集479份新鲜奶牛粪便样品,其中从惠州散养户采集82份,惠州龙华镇采集107份,惠州龙门县采集111份,深圳宝安区采集179份(表1)。通过直肠采集新鲜粪便样品并分别收集到单独的采样袋中,并标记采样地点、品种、年龄等信息,低温运输至河南农业大学兽医寄生虫学实验室,并置2.5%重铬酸钾溶液中4℃保存。

1.2 DNA提取与PCR扩增取200～300 mg粪便样品至1.5 m L 离心管中,加入1 m L 蒸馏水,3 500 r/min,离心5 min以洗去粪便样品中的重铬酸钾,直至上清无色透明。之后严格按照美国OMEGA Bio-Tek公司的粪便样品基因组DNA 提取试剂盒(E.Z.N.A Stool DNA kit,OMEGA)说明书步骤进行操作,将提取的样品DNA 置于－20℃保存,用于PCR 扩增。

基于SSU r RNA 基因位点对芽囊原虫进行PCR 扩增,引物及反应程序参照SCICLUNA 等[9]的报道。上游引物RD5：5′-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′；下 游 引 物 Bh RDr：5′-GAGCTTTTTAACTGCAACAACG-3′。试验中所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性1 min,59℃退火1 min；72℃延伸1 min,循环30 次；72℃再延伸5 min。每个PCR 反应均设置阳性和阴性对照。将PCR 扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳,置于紫外凝胶成像系统下进行拍照观察,扩增产物目的片段长度约为600 bp。所有的PCR 阳性样品扩增产物送至北京诺赛基因有限公司,用ABI PRISMTM3730 XL DNA 测序仪进行双向测序。

1.3 序列分析与亚型鉴定测序完成后,使用chromas 2.6(http：//www.technelysium.com.au)和Clustal X 2.1(http：//www.clustal.org)软件将测序得到的芽囊原虫双向序列进行比对组装,从而获得校正序列。将校正后的序列在NCBI 中的GenBank 数 据 库 中 进 行BLAST 检 索 (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),确定芽囊原虫的基因亚型。使用MEGA 7.0(http：//www.megasoftware.net)软件并采用邻接算法(Neighbor-Joining,NJ)、自展值为1 000、Kimura-2参数模型基于SSU r RNA 基因位点构建种系发育系统进化树。

1.4 统计学分析所有统计分析均采用SPSS22(http：//www.winwrap.com/)版软件,采用χ2检验分析广东省4个地区的奶牛场奶牛的芽囊原虫在不同地区、年龄组的感染率的差异,P＜0.05表明差异显著。

2 结果

2.1 芽囊原虫感染率在采集的479份粪便样品中,有9份确定为芽囊原虫阳性,广东地区奶牛芽囊原虫总感染率为1.88%(9/479)。其中,深圳宝安区芽囊原虫感染率为3.91%(7/179),惠州龙门县芽囊原虫感染率为1.80%(2/111),惠州散养户和龙华镇养殖场未发现芽囊原虫感染,统计学分析发现各地区之间感染率差异显著(P＜0.05)。对不同年龄段奶牛芽囊原虫感染率分析发现,断奶后犊牛感染率(3.38%,7/207)显著高于断奶前犊牛感染率(1.61%,2/124)(P＜0.05)。在育成牛(0/69)和成年牛(0/78)中未发现芽囊原虫的感染(表1)。

2.2 芽囊原虫亚型鉴定基于SSU r RNA 基因位点对广东地区奶牛芽囊原虫序列进行分析发现,9份奶牛芽囊原虫阳性样品中,5份与GenBank数据库中芽囊原虫ST10亚型位于同一进化支上,3份与GenBank数据库中芽囊原虫ST5亚型位于同一进化支上,1份与GenBank数据库中芽囊原虫ST3亚型位于同一进化支上(图1)。表明本研究共检测到3种芽囊原虫基因型,分别为ST3(1/9)、ST5(3/9)、ST10(5/9),其中,ST10亚型为本研究中奶牛芽囊原虫感染的优势亚型,ST3、ST5为人兽共患亚型。

图1 基于SSU r RNA 基因位点的芽囊原虫亚型NJ系统进化树▲.深圳宝安区阳品样品；●.惠州龙门县阳性样品

2.3 芽囊原虫亚型分布在深圳宝安区奶牛场共检测到3种亚型ST3、ST5、ST10,而惠州龙门县奶牛场共检测到2种亚型ST5、ST10,在惠州散养户和惠州龙华镇奶牛场未发现芽囊原虫的感染。对不同年龄段奶牛芽囊原虫亚型进行分析发现,断奶前犊牛感染的人兽共患亚型为ST3,断奶后犊牛感染的人兽共患亚型为ST5,ST10基因亚型在断奶前犊牛和断奶后犊牛均被发现,见表1。

3 讨论

芽囊原虫广泛寄生于人与动物的胃肠道中,在世界范围内均有报道。由于芽囊原虫具有广泛的宿主范围,且不同宿主来源的芽囊原虫在形态学上缺乏独特的特征,目前对芽囊原虫的分类、致病性、基因分型和作用仍存在争议[10]。近年来,基于芽囊原虫在SSU r RNA 基因位点的遗传多样性研究,已经积累了大量非人类宿主源芽囊原虫STs数据。然而,国内关于奶牛芽囊原虫感染情况及遗传多样性研究缺乏数据支持,仅在我国东北地区有奶牛感染芽囊原虫的报道[7-8]。因此,本研究以芽囊原虫SSU r RNA 基因位点为靶点,采用分子生物学方法对我国广东地区奶牛芽囊原虫的感染率和亚型分布进行了调查。

表1 广东地区部分奶牛场芽囊原虫感染相关情况

研究结果显示,广东地区奶牛芽囊原虫总感染率为1.88% (9/479),低于我国黑龙江地区(9.5%)[8],以及伊朗(9.7%)[11]和日本(54.1%)[12]等国家奶牛芽囊原虫感染率。造成这种差异的原因可能与采样季节、宿主年龄及地理区域有关。此外,相比于芽囊原虫在我国黑龙江省绵羊(5.5%)、猪(8.8%)[8]及 陕 西 地 区 山 羊 (58%)[13]、猪(74.8%)[14]的感染率,广州地区的奶牛芽囊原虫感染率偏低,可能与不同宿主、生态环境及检测方法等因素有关。研究表明,芽囊原虫感染率在不同年龄段宿主之间存在较大差异[12]。本研究发现,芽囊原虫在犊牛中的感染率显著高于育成牛及成年牛,且断奶后犊牛芽囊原虫感染率显著高于断奶前犊牛,这与ZHU 等[7]和WANG 等[8]的研究报道一致。

本次调查在广东省奶牛中共检测到3种芽囊原虫亚型(ST3、ST5、ST10)。其中,ST3、ST5为人畜共患亚型,断奶前犊牛检测到2种亚型ST3、ST10,断奶后犊牛检测到2种亚型ST5、ST10,表明断奶前后犊牛都能感染芽囊原虫人兽共患亚型,ST10亚型广泛分布于断奶前后犊牛。在世界各地,也经常有ST5、ST3亚型感染人的报道[15-16],以人源亚型ST3为主,ST5多见于牛、羊、猪和狗[17],提示该地区奶牛芽囊原虫具有潜在的人畜共患风险,需做好防控措施。此外,本次调查还发现ST10 亚型为奶牛感染芽囊原虫的优势亚型,与ZHU 等[7-8,12]在中国黑龙江地区、丹麦和日本东部地区的研究结果一致,提示ST10亚型是奶牛感染优势基因亚型。

综上所述,本研究首次对广东地区奶牛芽囊原虫感染情况进行调查,共发现3种芽囊原虫基因型。其中,ST10为感染优势基因亚型。人兽共患亚型ST3、ST5的发现,提示芽囊原虫在本地区具有潜在的人畜共患风险。关于我国奶牛芽囊原虫的感染情况及亚型分布情况,需要更多的研究来阐明其人畜共患风险及公共卫生学意义。