氢化可的松对保存过程中猪精子的影响

孙欢欢,王 娜,孙良振,郭海涛,王婧然,杨 康,周佳勃,谭景和,2∗ (.东北农业大学 生命科学学院 黑龙江省动物细胞与遗传工程重点实验室,黑龙江 哈尔滨50030；2.山东农业大学 动物科技学院,山东 泰安2708)

近年来,随着工作压力的激增、生活节奏的加快、就业竞争的激烈,多种多样的应激原浮现在我们的日常生活中,应激的增加逐渐成为多种生理功能障碍的诱因,甚至能导致多种疾病的发生发展。研究表明,应激是对雄性生育能力最有影响力的因素之一[1]。

应激会增强下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的活动,并且促进肾上腺皮质分泌糖皮质激素。应激状态下的小鼠血清皮质酮从0.1 mg/L 显著升高到0.2～1.0 mg/L[2]；皮 质 醇 从0.01 mg/L 升 高 到0.05 mg/L[2-3],促肾上腺皮质激素可显著提高母猪皮质醇质量浓度[4]。糖皮质激素(glucocorticoid,GC)参与调节多种生理过程,包括能量代谢、炎症、免疫、生长、渗透调节、神经元功能和动物行为等[5]。在体内,应激水平的血浆GC 质量浓度能显著增加青春期和成年期大鼠生精细胞凋亡比例。在皮质醇增多综合征中,高质量浓度GC 也是与生精障碍和无精症密切有关。试验表明,外源性GC 引起的生殖细胞的凋亡可完全被糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)拮抗剂所抑制,所以GC可能是通过GR 调节的转录基因直接作用于生精细胞的,但其机制还不清楚。

GC对精子影响的研究主要集中于精子发生阶段,主要在体内,但是体内环境是受多因素共同作用的,不同条件下得到的试验结果存在差异。有报道认为口服低剂量可的松或氢化可的松是一种有望治疗少精子症的方法[6-7]。然而,也有报道表明采用该方法对患有先天性不育的男性进行治疗并没有提高患者精子的受精能力也没有增加患者精子总数或精子活率[8]。因此,本研究以体外保存过程中的猪精子为研究对象,排除体内复杂因素的干扰,旨在进一步探讨GC对猪精子是否存在影响,为降低应激,以及GC对雄性动物生殖的影响提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂除特殊说明外,本研究所用试剂均来自Sigma-Aldrich公司产品。

BTS稀释液作为保存液,其包含205.37 mmol/LD-葡萄糖,20.40 mmol/L 二水柠檬酸钠,3.69 mmol/L乙二胺四乙酸二钠,14.88 mmol/L 碳酸氢钠,10.06 mmol/L 氯化钾,50 IU/m L 青霉素钠,0.1 g/L 硫酸链霉素；p H 7.2。

1.2 精液采集与保存精液采自5头健康可育长白种公猪,用手握法采集富精期的浓精液。将采集的鲜精液温度保持在35℃,30 min内运至实验室。镜检精子活力≥80%以上的精液样品用于试验。鲜精液避光置于室温2 h使温度缓慢降至室温,将精液按稀释比例分装于15 m L的离心管中,离心去除精浆；然后分别用含有不同质量浓度(0.1,0.25,0.5,10.0,50.0 mg/L)氢化可的松、50μmol/L米非司酮以及氢化可的松和米非司酮联合作用的保存液稀释,不含氢化可的松的处理作为对照组,分装至1.8 m L 冻存管中,使精子的终浓度为3×107～5×107个/m L。将含有不同处理的冻存管置于17℃恒温箱中保存5 d,每隔24 h取精液样本并检测。

1.3 精子活力检测在检测前将精子样本混匀并放到37℃恒温箱中预热20 min,使用清华同方精子分析仪(MX 7.5)分析精子的各项运动参数。取10μL预热后的精子样本涂于计数池上,每次检测6个视野,精子数量不少于200个。

1.4 精子蛋白的Western blot分析取1 m L 精液,1 500 r/min离心10 min,弃上清,并用PBS洗涤2次,每次10 min；离心后的沉淀重悬于含有蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液中,并进行超声处理,处理后的样品在冰上裂解40 min。将等量的蛋白质煮沸10 min,然后用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并转移到PVDF 膜上。将PVDF 膜用5%脱脂奶粉37℃封闭1 h,一抗4℃孵育过夜。次日,用PBST 缓冲液洗去一抗后用山羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗37℃孵育1 h。PBST 缓冲液洗去二抗后用ECL Plus蛋白质印迹检测系统显示印迹。β-actin(1∶1 000,＃M20615,TransGen Biotech)；GR(1∶1 000,＃ WL02695,Wanleibio)。

1.5 精子免疫荧光检测取1 m L 精液,1 500 r/min离心5 min,弃上清并用PBS洗涤2次,然后取60μL 细胞悬液加入到200μL 温热的PBS 中,1 500 r/min 离心5 min；弃上清,沉淀重悬于200μL 4%多聚甲醛中,固定30 min后,去除多聚甲醛并用200μL含0.1%Triton X-100的PBS缓冲液通透20 min,并对GR 进行免疫荧光染色处理。然后用含10%正常牛血清(BSA)的PBS缓冲液室温封闭1 h后,使用兔多克隆抗GR 作为一抗,FITC标记的山羊抗兔IgG 作为二抗孵育同上。在倒置荧光显微镜下观察。GR(1∶200,＃ WL02695,Wanleibio)。

1.6 精子DNA 完整性的检测根据VIRANT等[9]报道的方法,取20μL精子悬液涂于载玻片上。风干后,在Carnoy溶液(甲醇/醋酸,3∶1)中固定过夜。冲洗风干后,将载玻片用新鲜制备的吖啶橙(AO)染色剂染色5 min,洗涤干燥后,立即在倒置荧光显微镜400倍下观察。具有染色质完整的精子头部呈现绿色荧光,具有染色质变性(DNA 不完整)的精子头部呈现橙红或黄色荧光。

1.7 精子线粒体膜电位的检测采用MitoProbe JC-1试剂盒对线粒体膜电位进行检测[10]。取0.5 m L 精子数量为2×106个精子的样品,加入0.5 m L JC-1染色工作液,颠倒数次混匀。在37℃培养箱中孵育20 min。37℃孵育结束后,4℃下1 000 r/min离心5 min。再用JC-1缓冲液(1×)重悬后,涂片,倒置荧光显微镜400倍下观察。

1.8 精子凋亡的检测精子凋亡水平采用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒进行检测[11]。测时,先将1 m L 精液1 500 r/min离心5 min,弃上清,再用0℃的PBS重悬并计数。将精子(1×106)重悬于500μL 的结合缓冲液中,并与10μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 一 起 避 光 室 温 孵 育20 min,通过流式细胞仪测量凋亡率(%)。

1.9 数据统计与分析数据用平均数±标准误(±s x) 表示。每个试验处理至少重复3次,数据使用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析,P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 氢化可的松对保存过程中精子活力的影响

如图1可知,在保存猪精液过程中各组活力均随保存时间的延长而逐渐降低。0.1 mg/L 氢化可的松处理组与对照组(0.0 mg/L)差异不显著。0.25～50.0 mg/L 从保存第1天起与对照组和0.1 mg/L组精子活力出现差异,且随着氢化可的松作用时间的延长精子活力显著降低(P＜0.05)。高质量浓度的氢化可的松组(10.0～50.0 mg/L)精子活力下降幅度更大,显著高于对照组。

图1 不同质量浓度的氢化可的松对精子活力的影响 注：所标字母不同者表示差异显著(P＜0.05)

2.2 GR在猪精子中的表达采用Western blot方法检测射出的猪精子是否存在GR 的表达,结果如图2所示,5头不同公猪射出的精子混合样品都检测到了GR 蛋白的表达,相对分子质量95 000,其中用小鼠精子作为阳性对照。

图2 猪精子蛋白的Western blot分析 P1,P2.混合样品；Ms.小鼠精子阳性对照；β-actin.上样对照

图3 猪射出的精子中GR 的免疫定位 A.光镜下的猪精子；B.GR 在猪精子中的表达(400×)

采用免疫荧光技术进一步研究GR 的在猪精子上的定位,如图3所示GR 主要表达在猪精子顶体后区及尾部中段线粒体鞘周围,而尾部其余部分未见信号；提示GR 受体可能在氢化可的松作用精子过程中起作用。

2.3 米非司酮与氢化可的松联合作用对精子活力的影响米非司酮是GR 的竞争性抑制剂。采用50μmol/L米非司酮抑制GR,结果如图4所示,米非司酮可有效拮抗氢化可的松的作用,精子保存第5天时氢化可的松＋米非司酮处理组精子活力显著高于氢化可的松单独处理组(P＜0.05),与对照组差异不显著。近一步证实氢化可的松可能是通过其受体作用于精子的。

2.4 氢化可的松对体外精子DNA碎裂(DFI),线粒体膜电位(MMP)和细胞凋亡的影响在添加或不添加50μmol/L米非司酮的条件下,用0.25 mg/L氢化可的松体外保存猪精液5 d后检测氢化可的松对DFI,MMP以及精子细胞凋亡的影响,结果见表1。

对DNA 碎片指数(DFI)的影响：氢化可的松处理组精子DFI(23.77±1.17)%显著高于对照组(12.50±1.54)%(P＜0.05),氢化可的松＋米非司酮处理组(13.84±1.67)% 与对照组差异不显著。

精子线粒体膜电位(MMP)影响：氢化可的松处理组精子MMP(27.19±1.55)%显著低于对照组(59.51±2.09)%和与米非司酮联合处理组(58.92±1.55)%,而后2组差异不显著。

图4 米非司酮与氢化可的松联合作用对猪精子活力的影响 注：同列数据所标字母不同者表示差异显著(P＜0.05)。下同

对细胞凋亡的影响：氢化可的松促进精子细胞凋亡,细胞凋亡比例显著高于对照组及与米非司酮联合处理组。

表1 氢化可的松对体外精子DFI、MMP和精子凋亡的影响 %

3 讨论

应激反应会促进肾上腺皮质分泌糖皮质激素(GC),长期处于高水平GC 的作用下能够损伤生精上皮,导致生殖细胞和支持细胞间隙扩大,生殖细胞结构受损,影响生殖细胞的正常功能,雄激素合成减少,精子发生障碍[12]。然而GC 对射出的成熟精子是否有影响还有待于研究。事实上,哺乳动物精子在雄性和雌性生殖道中的迁移过程,生殖道为它们提供了一个与各种激素相互作用的机会。许多的研究表明哺乳动物雄性和雌性生殖道中存在大量类固醇激素[13]。为了减少体内多种因素的干扰,本研究采用BTS为猪精液稀释液,在该稀释液中17℃保存7 d的猪精液,仍可稳定维持活力60%以上[14],为研究GC对精子的影响提供了一个比较适宜的研究体系。有报道表明血清中GC 的生理质量浓度约为0.1 mg/L[15-17]；应激状态下猪血清中皮质醇的质量浓度达到0.25 mg/L[18]。因此本研究中采用的氢化可的松的质量浓度分别为0.1,0.25,0.5,10.0 和50.0 mg/L。结果表明,生理质量浓度0.1 mg/L 氢化可的松对猪精子活力影响不大,但是应激质量浓度0.25,0.5 mg/L氢化可的松处理组可降低精子的活力,特别是长期作用下精子活力显著降低。而高质量浓度的氢化可的松组(10.0～50.0 mg/L)精子活力下降幅度更大。

GC需要结合到糖皮质激素受体(GR)形成复合体后,在热休克蛋白的作用下进入到细胞核内,作用于下游转录因子从而发挥生物学效应。研究表明小鼠成熟精子存在GR 的表达[19],猪的射出精子是否表达GR 如何定位尚未见报道。本研究中采用Western blot和免疫荧光的方法进行定位及定量的研究,证明猪精子存在GR 的表达,而且集中表达在猪精子顶体后区及尾部中段线粒体鞘周围,而尾部其余部分未见信号,提示GC 很可能通过GR 起作用,而且很有可能影响精子线粒体功能。采用GR抑制剂米非司酮可拮抗氢化可的松作用,进一步证实了我们的猜想。体外保存5 d,与对照组相比0.25 mg/L氢化可的松可显著降低精子活力,而米非司酮与氢化可的松联合作用组精子活力与对照组差异不显著(P＞0.05)。

为了进一步研究氢化可的松对精子的影响,采用0.25 mg/L的氢化可的松体外保存猪精液5 d后检测氢化可的松对DFI、MMP 以及精子细胞凋亡的影响。结果表明,长期应激质量浓度的氢化可的松处理组DFI显著提高,MMP降低,细胞凋亡比例提高,米非司酮可有效拮抗氢化可的松的作用,表明氢化可的松可能是通过与其受体GR 结合,干扰线粒体功能从而促进细胞凋亡。TOME 等[20]报道,合成的GC地塞米松会诱导小鼠胸腺淋巴细胞的凋亡且线粒体是该凋亡信号传导的核心。这些结果进一步证明GC可能间接启动线粒体凋亡通路来影响猪精子。

综上所述,保存过程中添加0.25 mg/L 氢化可的松开始会降低精子活力影响精液质量。添加50μmol/L 米非司酮可拮抗氢化可的松的作用提高精子活力。在长期(5 d)应激质量浓度氢化可的松作用下,精子DFI增加,线粒体功能下降,凋亡比例增加,这些作用可以被米非司酮拮抗。表明氢化可的松可能是通过与其受体GR 结合干扰线粒体功能从而促进细胞凋亡。这些结果为降低应激,以及GC对雄性动物生殖的影响提供理论参考。