环状RNA在缺氧窒息死亡原因推断中的意义

关远凯 陈 说

（1.东莞市公安局塘厦分局刑警大队，广东 东莞523710；2.广州医科大学，广东 广州511436）

真核细胞基因组仅有约2%为可编码蛋白质的信使RNA（mRNA），而75%-90%的RNA是非编码 RNA （ncRNA）［1］。近年来，随着RNA测序（RNA-seq）的应用和发展，科学家们发现了一种新型的内源性非编码RNA：环状RNA（circular RNA，circRNAs）。circRNA结构上高度保守且共价闭合，最早被Kolakofsky以及Sanger等人发现于类病毒颗粒，随后逐渐在动物细胞以及真核酵母中得到验证。2012年Salzman等人对circRNA进行了全面和系统报告，越来越多的环状RNA逐渐被研究者发现，特别是其作为“miRNA海绵”在基因表达调控中发挥的作用，已成为新的研究热点。

circRNA广泛存在于外周血中，不易被RNA酶降解，稳定性高，因而有助于推断窒息死亡后陈旧血迹及尸体的时间。本综述对circRNA的特征，其形成和功能，以及缺氧相关环状RNA在窒息死亡原因推断中的意义进行阐述。

1 CircRNA的结构特点

circRNAs长度约为几百至几千个核苷酸，其独特的闭合环状结构使其缺乏5’末端帽子、3’末端多聚腺苷酸（polyA）尾。

circRNA具有以下重要特征：（1）闭环结构：因此耐受核酸外切酶，相比于同源线性RNA，稳定性更高；（2）在体内广泛表达，表达水平具有组织特异性，与其同源线性RNA的表达水平无相关性，有时甚至是其同源线性RNA的10倍以上；（3）多数circRNA具有高度保守的序列；（4）大多数circRNA位于细胞质中，而少量内含子衍生的circRNA位于细胞核中［2］；（5） 大多数circRNA包含外显子序列，而其中少数是通过内含子环化形成的［6］；（6）一些circRNA富含来自外显子的miRNA应答元件（MRE）；（7）circRNA在转录或转录后水平发挥调控作用。

2 CircRNA的形成机制

环状RNA来源于其亲本基因的转录，由前体mRNA通过非经典的选择性剪接产生，根据其来源分为以下三类。

2.1 外显子来源的circRNA（exonic circRNA，ecircRNA）

超过80%的circRNA是ecircRNA,Jeck等人通过系列研究确定了两种ecircRNA模型：（1）套索驱动的环化（Lariat-driven circularization）；（2）内含子配对驱动的环化（Intron-nairingdriven circularization）。Wilusz和 Sharp证明，circRNA分子主要通过反向剪接产生。

2.2 内含子环状RNA（circular intronic RNA，ciRNA）

ciRNA是指内含子独立环化形成环状内含子RNA，其主要存在于某些组织的细胞核中，多位于5’剪切位点与3’分支点附近，富含GU序列与富含C序列的共价模体诱导合成，内含子环化后再经过剪除尾端及分支点序列，形成内含子环状结构；此外，RNA结合蛋白（RBPs）可以诱导剪接受体与供体直接连接，再经过内含子剪切，形成完整的外显子环状结构。

2.3 外显子-内含子circRNA（ElciRNA）侧翼内含子序列包含的在内含子环化

Salzman等人发现ElciRNA由外显子和内含子共同组成。外显子环化主要依赖外显子侧翼的长内含子序列，而侧翼内含子序列包含的反向序列（如ALU）在内含子环化时起重要作用。通常情况下，围绕外显子的内含子被拼接出来；而在某些情况下，它们被保留，并被命名为保留内含子的circRNA或ElciRNA［3］。

3 CircRNA的生物学功能

3.1 miRNA海绵作用

环状RNA通过其含有的miRNA应答元件（MRE，microRNA response element） 竞争性结合miRNA，解除miRNA对下游靶基因的抑制，发挥“miRNA海绵”的作用，从而参与竞争性内源 RNA （ceRNA,competeing endogenous RNA）网络。目前研究最多的是CDR1-as，具有70余个保守的miR-7结合位点。Xu等人研究表明CDR1-as能够结合miR-7与AGO2蛋白形成的RISC，解除miR-7对靶基因的抑制，从而在肿瘤发生、发展的相关通路中发挥重要作用。

3.2 调控RNA结合蛋白

circRNA可通过与蛋白质结合抑制其活性、募集蛋白质复合体的组分或调控蛋白质的活性，为蛋白质与RNA，DNA以及蛋白质之间的相互作用提供平台。例如：circ-Foxo3通过结合细胞周期素依赖激酶2（CDK2）以及CDKs抑制剂P21形成circ-Foxo3/p21/CDK2三元复合体，促进细胞周期阻滞。

3.3 调控基因转录

circRNA可以定位于转录起始位点附近，结合RNA聚合酶II复合体，影响转录，从而对其源基因发挥顺式调控作用或者反式调节作用。Ashwal-Fluss等人研究发现剪接因子MBL的第二个外显子可以环化形成circRNA，其与前体mRNA的线性剪接竞争并影响线性RNA的形成以调节相关基因表达［4］。

3.4 参与蛋白质翻译

研究表明，circRNA除了可以在RNA水平发挥功能，也可以像线性mRNA一样翻译形成蛋白质。Legnini等人研究发现circ-ZNF609含有相同于线性转录本的开放阅读框，从起始密码子开始终止于环化形成的框内终止密码子［5］。Yang等人发现N6-甲基腺苷（m6A）通过RNA碱基修饰，促进了circRNA蛋白质翻译功能的有效启动。最近，研究发现circRNA在人骨肉瘤细胞中具有蛋白翻译功能，但其翻译效率明显低于线性RNA。

4 CircRNA在缺氧窒息中的研究进展

人体呼吸过程由外呼吸、血液中气体运输和内呼吸三个阶段共同构成。三者中任一阶段受阻或异常，均可导致全身各组织器官缺氧，呼吸障碍、氧气不足、二氧化碳滞留，进而引起相应细胞代谢障碍、功能紊乱和形态结构损害，整个过程称为窒息（asphyxia），因窒息而导致的死亡称为窒息死（asphyxial death）。

在法医学实践中通常根据颜面部淤血发绀肿胀、瘀点性出血、尸斑出现的时间分布、尸冷进展速度、牙齿浸染等尸表征象，结合内部器官淤血、器官被膜下瘀点性出血、肺气肿水肿等尸体内部征象，判断尸体死因是否为缺氧窒息死亡。当尸体腐败、现场被破坏、尸体检验中未发现明显阳性体征时，往往难以确定死亡原因。法医学鉴定受血液成分复杂性及死后环境因素等的影响，血液pH值变化、血气分析及血液离子浓度改变等检测方法存在不确定性。近年来，研究者试图通过分子生物学手段建立缺氧窒息相关动物模型，检测HIF相关基因的蛋白和mRNA表达水平变化，筛选窒息死亡相关的辅助诊断指标。但由于尸体样本死亡时间不等，蛋白质、mRNA等分子发生不同程度的降解，因而死亡原因推测具有一定局限性。circRNA广泛存在于外周血中，不容易被RNA酶降解，稳定性高，因而对窒息死亡后陈旧血迹及陈旧尸体中的时间推断可能具有重要意义。

4.1 缺氧对circRNA生物合成及活性的影响

Hsiao等人通过体内体外实验研究表明，缺氧应激能促进circCCDC66积累，促进细胞增殖、迁移和转移，并且由于自身的稳定性能加强这种积累作用，提示circRNA可能在缺氧缺血所致损伤的病理过程中具有重要作用。

Boeckel等人研究表明缺氧条件下可以诱导circZNF292、circAFF1和circDENND4C的表达，下调内皮细胞中cTHSD1表达，且缺氧条件下诱导的circZNF292在体外实验中表现出促血管生成活性［6］。

4.2 circRNA在缺氧中的功能以及在窒息死亡原因推断中的意义

Dang等人研究表明在缺氧条件下HUVEC细胞中circ_0010729表达上调，且可通过靶向调节miR-186/HIF-1α影响血管内皮细胞增殖和凋亡。HIF（hypoxia-inducible factor，缺氧诱导因子）是一种受氧浓度调节的转录激活因子，在缺氧条件下可激活包括碳酸酐酶9（CA9，carbonic anhydrase 9）、葡萄糖转运子1（GLUT1，glucose transporter 1）在内的100多种缺氧反应性基因表达［7］，参与窒息死亡的不同阶段，具有作为窒息标志物的可能性。Liang等人研究表明circDENND4C在缺氧条件下含量增加，而HIF1α表达水平下调后又可导致circDENND4C含量减少，这表明circDENND4C是一种HIF1α相关的circRNA。因而当前针对circRNA与缺氧的相关研究，特别是与HIF的相互调控研究，可能为寻找窒息死亡原因特异性标志物提供依据。

5 展望

虽然多种死亡机制均可归结为组织器官缺氧，但不同的死亡机制在不同脏器内会存在缺氧程度的不同，颈部血液循环受阻造成的窒息往往脑组织先缺氧，而溺水死亡则是肺部首先缺氧。circRNA通过调控miRNA/HIF等途径参与多种缺氧反应过程，为从分子水平深入阐述缺氧窒息所引起的机体死亡机制提供了线索。研究人员已经发现了在缺氧时含量或活性发生改变的一系列 circRNA:cZNF292、cAFF1、cDENND4C、cTHSD1、circZNF292、circ_0010729以及circDENND4C，为窒息特异性标志物的筛选提供了理论依据。也将在未来进一步深入分析不同窒息方式中器官内circRNA的定量差异，有助于对原因不明的窒息提供方向。

鉴于法医学鉴定受死亡时间、取材部位、年龄及性别等多种因素影响，因而窒息特异性标志物的筛选仍有待大量实验来验证。而且由于circRNA表达丰度较低，因而利用circRNA标志物进行窒息死亡原因的推断作为一种新的方法，如何应用于人尸体方面依然存在着研究上的空白，需要进一步深入探索。