黑曲霉的产酸优化和对鸡粪的间接生物浸出效果

钟裕健，郑莉，孙水裕，许燕滨，杜青平，谢光炎，刘艳婷，蔡秋杰，谢志帆

(广东工业大学 环境科学与工程学院，广东 广州 510006)

近30年来，我国畜禽养殖业迅速发展。为了加快畜禽的生长、增强畜禽的抗病能力，追求经济利益最大化，饲料中通常添加过量的铜、锌、砷等微量元素，远远超过畜禽的吸收率[1]，并通过粪便和尿液的形式排出体外，导致粪便中重金属含量过高[2]。畜禽粪便富含有机质和养分，是传统的有机肥料[3]，但这些畜禽粪便作为肥料用于农田后会造成重金属的积累，并可能对人体健康造成危害[4]。目前常规有效的解决方式有物理和化学方法两种[5]，成本高且容易造成其他环境污染。随着生物浸出方法的研究，由于其克服上述缺陷，运行成本低、应用范围广、操作简单和污染小的优点引起了业内外的广泛研究和关注[6]。

生物浸出技术最早应用于矿石中提取有用金属[7-8]，根据这一原理应用于污染物的重金属去除，发展为生物浸出技术[9]。现有的相关生物浸出方法多采用化能自养型细菌，或者是将自养和异养细菌混合培养投入使用。研究发现，部分异养菌在生物浸出时表现也较为优异。黑曲霉(Aspergillusniger)是目前在生物浸出中常用的真菌。其在生长代谢过程中产草酸、葡萄糖酸和柠檬酸等有机酸[10-12]，通常应用于污染土壤中浸出重金属，并取得较好的效果。目前黑曲霉生物浸出主要应用于低品位矿石或尾矿[13-15]、城市燃烧垃圾飞灰[11，16-17]、赤泥[18-19]、废弃电路板[20-22]，但对畜禽粪便的生物浸出报道比较少，尤其是黑曲霉间接生物浸出的研究。

本文选用黑曲霉作为畜禽粪便进行间接生物浸出，重点研究黑曲霉产有机酸的优化，生物浸出去除畜禽粪便重金属的效果以及浸出过程中重金属形态的变化。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

蔗糖、酵母浸膏、琼脂、硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸铁、磷酸、过氧化氢、盐酸、硝酸、氯化镁、醋酸、醋酸钠、醋酸铵、盐酸羟胺均为化学纯；鸡粪，取自广州市番禺某养鸡场(烘干，研磨过60目筛网)，基本性质分析见表1。

表1 鸡粪的基本理化性质

AUY220型电子分析天平；SHA-B型恒温振荡器；Sorvall Legend T型高速离心机；ZSD-A1090A型生化培养箱；OPTEC型光学显微镜；无菌操作台；LDZM-40KCS型高压蒸汽灭菌锅；PHS-25型pH计；Bio-rad S1000TM Thermal Cycler PCR仪；TSQ Endura三重四极杆液质联用仪；Z-2000型原子吸收光谱；AF-640A型原子荧光光谱。

1.2 菌种培养[23]

鸡粪在锥形瓶富集培养后，再涂布查氏固体培养基。利用溴甲酚绿的查氏筛选平板连续划线纯化得到数株菌。将相同浓度的不同菌种的孢子，分别接种在灭菌的蔗糖培养基(100 g蔗糖，1.6 g酵母浸膏，1.5 g NaNO3，0.5 g K2HPO4，0.025 g MgSO4·7H2O，0.025 g KCl，1 L去离子水)[24]，于30 ℃、120 r/min条件下振荡培养6 d，选取培养基pH最低的菌种样本进行鉴定。

1.3 实验方法

1.3.1 产酸实验 将黑曲霉在蔗糖平板上培养7 d，用无菌棉签刮下孢子，在装有无菌水的锥形瓶中洗下孢子，振荡摇匀，配制成黑曲霉孢子悬浮液，在显微镜下用血球计数板计算浓度，经过进一步的稀释后，孢子浓度约为1.0×107个/mL。在无菌蔗糖培养基中接入20 mL/L的孢子悬浮液，于30 ℃、120 r/min条件下进行纯培养，每2 d取培养液进行有机酸的测定。

1.3.2 间接生物浸出实验 在黑曲霉产酸优化的实验中，选择产酸量最大的一组进行生物浸出实验。培养液经过滤纸过滤得到无细胞培养滤液，用于鸡粪的浸出[25]。在锥形瓶中装入100 mL的培养滤液，加入40 g/L的鸡粪样品，瓶口盖上棉纱。置于30 ℃，180 r/min的恒温振荡器内进行浸出实验。实验器皿都经过灭菌处理。每组实验设置3个平行样。浸出过程中，每4 h取上清液，测定其中的重金属浓度(Cu、Zn和As)。

通过Tessier五步法[25]测定浸出过程中鸡粪重金属的形态变化。提取步骤见表2。准确称取1 g(精确到0.000 1 g)鸡粪样品，每个形态提取完后，进行15 000 r/min离心15 min，保留沉淀的样品，上层清液用于测定重金属含量。沉淀样品用去离子水洗涤2次后，离心，弃去上层清液，然后进行下一个形态的提取。

表2 Tessier五步提取法Table 2 Tessier’s five step of extraction procedure

1.4 分析方法

鸡粪用微波消解仪消解，重金属含量用火焰原子吸收光谱仪和原子荧光光谱进行测定[26]，有机质含量用燃烧法进行测定，有机酸含量用三重四极杆液质联用仪测定。

2 结果与讨论

2.1 菌株鉴定

2.1.1 形态学鉴定 观察菌种样本培养在蔗糖平板中的菌落状态，用显微镜观察孢子的形态结构等。结果见图1。

图1 黑曲霉在平板(a)和显微镜下(b)的形态特征Fig.1 Morphological photographs of Aspergillus niger on PDA medium (a) and microscope (b)

由图1可知，菌株在蔗糖培养基上培养3 d，出现圆形的菌落，表面为毛绒状的突起；培养初期为黄白色的菌丝，后生长成黑褐色的孢子。根据《真菌鉴定手册》，初步判断筛选所得菌株为黑曲霉(Aspergillusniger)[23]。

2.1.2 分子生物学鉴定 采用真菌DNA试剂盒提取菌种样本的DNA，并进行PCR扩增18S rDNA-ITS序列，对序列双向测序与NCBI数据库内库序列比较，发现18S rDNA-ITS序列和Aspergillusniger相近，同源度仅存在1%的差异性。将序列提交到NCBI后，该黑曲霉菌株的登录序列号为MH978907。采用MEGA 5.0软件构建该菌的系统发育树(图2)。结合形态观察和培养特性的初步鉴定，确认筛选所得菌株为黑曲霉(Aspergillusniger)[27]。

图2 黑曲霉菌株的系统发育树

2.2 产酸条件优化

2.2.1 产酸特性 黑曲霉在生长代谢过程中，将简单高分子碳水化合物如蔗糖转化为柠檬酸、葡萄糖酸、草酸等低分子有机酸，导致体系的pH逐渐下降，从初始的5.7下降到1.5。

由图3可知，培养6 d，葡萄糖酸产量达到最高(17.50 mmol/L)，后期基本趋稳，略有下降，维持在10 mmol/L左右；草酸的产量迅速增加，第4 d达到14.28 mmol/L，随后逐渐降低，在15 d降低至2.60 mmol/L。柠檬酸的浓度则随着培养时间上升。有研究指出，体系中的pH对黑曲霉分泌葡萄糖酸有很大影响，在pH 4.5～6.5时葡萄糖氧化酶的活性最大，葡萄糖酸的产量也最多，在pH<3.0时氧化酶的活性受到抑制，从而导致葡萄糖酸的产量速率下降[28]；而培养4 d后，草酸可能参与柠檬酸的代谢循环被分解，导致草酸的浓度下降，柠檬酸的浓度持续上升[23]。总体上看，培养15 d时柠檬酸的产量最高(71.34 mmol/L)，而葡萄糖酸(10.47 mmol/L)处在较稳定水平，草酸(2.60 mmol/L)有所下降，培养液的pH接近 1.5，这一酸性环境有利于将畜禽粪便的重金属浸出。崔雨琪[23]曾报道黑曲霉纯培养20 d产酸分别为：柠檬酸约55 mmol/L，葡萄糖酸约20 mmol/L，草酸约16 mmol/L。由于柠檬酸的产量远大于其他两种有机酸，且柠檬酸对重金属浸出起主要作用，因此，设计正交实验优化柠檬酸的产量。

图3 黑曲霉产酸趋势图

2.2.2 正交实验 以蔗糖浓度、接种量和培养温度3个因素设计L9(34)正交实验，确定产酸的最优条件，因素与水平见表3。每种实验重复3次，结果见表4。

表3 正交实验因素水平

表4 正交实验结果Table 4 Result of orthogonal experiment

由表4可知，3种因素对柠檬酸的产量的影响由大到小依次为培养温度(C)、接种量(B)、蔗糖浓度(A)。其最优方案是A2B2C2，即培养基的蔗糖浓度为100 g/L、接种量为40 ml/L、培养温度为30 ℃。

对最优方案进行验评实验，平行3次，结果柠檬酸产量为71.23 mmol/L，因此，上述条件最适合黑曲霉产柠檬酸。

2.3 重金属浸出率

图4为鸡粪中各重金属去除过程的动态变化情况。

图4 间接生物浸出鸡粪的重金属浸出动态Fig.4 Trends in metal removal of chicken manure by indirect bioleaching

由图4可知，含有大量有机酸的培养滤液对鸡粪重金属浸出有不错的效果。间接浸出主要的作用机理是酸解。酸化(质子流出)有利于金属迁移，而且是真菌浸出过程中最重要的机制，因为质子与金属阴离子中的金属之间的竞争或被吸收的形式，游离的金属阳离子释放到浸出液中，可导致固废中金属的迁移。酸解在浸出过程中的作用取决于培养滤液的pH。酸解和络合分解分别在强酸性和弱酸性条件下起作用。在酸解过程中，氢离子的浓度在碱性阶段下降，在碱性阶段，络合分解占据并控制了大部分金属的溶解[29]。浸出过程中，pH变化不大，从3.6升高到4.1。浸出4 h，Cu、Zn、As浸出率分别为55.35%，69.06%，34.53%。随着浸出时间加长，最终20 h的Cu、Zn、As浸出率分别为63.93%，79.22%，42.55%。Zn的浸出效果最佳，Cu次之。柠檬酸和葡萄糖酸是生物浸出中Cu和Zn的主要和有效的浸出剂[30]。Qu[18]曾报道间接浸出2%浓度的红泥，20 d后浸出率分别为Cu约50%，Zn约80%，As约40%。虽然本实验的浸出率比报道略有偏低，但是浸出时间缩短10 d。

根据《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)(GB 15618—2018)》[31]的农用地土壤污染风险筛选值规定，Cu、Zn、As的最低含量在50，200，20 mg/kg以下。由表5可知，经过生物浸出后，Cu、Zn和 As达到土壤环境标准，这说明生物浸出可以实现鸡粪重金属的减量化，鸡粪作为有机肥料用于农业施肥。

表5 农用地土壤污染风险筛选值和鸡粪重金属含量Table 5 Farmland soil pollution risk control standard and heavy metal content of chicken manure (mg/kg)

2.4 浸出过程中重金属形态变化

金属形态的分布代表鸡粪中重金属的稳定性和生物有效性，也代表生物浸出的效率。根据Tessier[26]分类重金属形态有5种，而且具有不同的能量状态。可交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态，这3种的稳定性更差，有较高的风险性和生物可利用性。有机物结合态和硫化物结合态、残留态相对比较稳定，更难被生物利用[25]。

对生物浸出不同阶段的鸡粪样品进行重金属提取的结果见图5。

图5 生物浸出过程中Cu、Zn、As的重金属形态变化Fig.5 The variation of Cu，Zn and Asspeciation during the bioleaching

由图5可知，生物浸出对残留物中金属的形态有明显的变化。对于原始样品而言，Cu的重金属形态主要集中在有机物结合态和硫化物结合态(84.83%)。浸出20 h后，占比从84.83%减少至33.77%，其他重金属形态的比例仅有微量的减少。对于Zn，重金属形态大部分为铁锰氧化物结合态(56.91%)、有机物结合态和硫化物结合态(27.56%)。浸出20 h后，铁锰氧化物结合态下降到13.64%，而有机结合态和硫化物结合态则是下降到5.11%。前12 h，残留态的比例随时间下降，后8 h却略微上升，推测是铁锰氧化物结合态的溶解导致残留态的增加。生物浸出对各形态的As均有减少，铁锰氧化物结合态减少19.34%，残留态减少9.12%，其他3种形态平均减少6%。考虑到原鸡粪中5种形态的占比，4种形态的As降低幅度接近(5%～8%)，而残留形态的降低幅度最少(2%)。表明残留态的As比较稳定，不易被浸出。

经过黑曲霉培养滤液的浸出后，鸡粪的生物有效性大大降低(表6)。根据风险评价准则 (RAC)[32]，以生物有效性较高的重金属形态所占的比例W将风险程度分为以下5种：无(W<1%)、低(1% ≤W≤10%)、中等(11% ≤W≤30%)、高(31% ≤W≤50%)、非常高(W>50%)。经过20 h的浸出之后，Cu和As的生物有效性很低(约为2%和9.71%)，RAC等级划分为低，这说明浸出后Cu和As的可生物利用性低，对环境构成的风险较低；而Zn对环境构成的风险从非常高(64.05%)，降低到中等(14.72%)，这说明生物浸出大大降低了Zn的生物利用性。只需经过再一步的无害化处理，鸡粪对环境构成的风险更低。

表6 鸡粪经生物浸出后的生物有效性Table 6 Bioavailability of chicken manure after bioleaching

3 结论

(1)从鸡粪中分离得到产酸黑曲霉，黑曲霉生长代谢过程中分泌葡萄糖酸、柠檬酸和草酸，柠檬酸的产量远超过其他有机酸。在优化条件蔗糖浓度100 g/L、接种量40 mL/L、温度30 ℃下柠檬酸最大产量约为71.23 mmol/L。

(2)经过20 h的间接生物浸出后，重金属Zn浸出率最高，为79.22%，Cu和As浸出率分别为63.93%，42.55%，达到新实施的土壤环境质量标准。

(3)生物浸出对鸡粪中3种重金属的形态有明显的影响。生物浸出后，鸡粪的生物可利用性有不同程度的降低，对环境构成的风险大大降低。