空卵泡综合征患者家系的LHCGR基因突变检测及系谱分析

王丽婷 王成祥 孙洪亮 王雁林 李清春

滨州医学院附属医院生殖医学科 山东 滨州 256603

空卵泡综合征(Empty follicle syndrome, EFS)是一种生殖障碍，尽管卵泡发育和雌二醇(E2)水平明显正常，但在进行体外受精(In vitro fertilization, IVF)治疗过程中，对患者进行诱导排卵后反复抽吸和冲洗成熟的卵泡，也无法获取卵母细胞。EFS是否真正存在一直有争议，部分学者认为EFS是由取卵过程中出现的操作失误及药物活性低下所致，有些学者则认为EFS是由卵泡发育障碍而导致的早期卵泡闭锁，还有一部分人认为这可能与遗传或基因突变相关。虽然文献报道EFS发生率仅为0.045%～7%，但对其病因尚未有确切解释，且对这种妇女成功生育的治疗目前尚未有报道，严重影响了这部分患者的辅助生殖助孕结局及治疗前景。本文通过对1例EFS患者进行基因检测和家系分析，探究促黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体(Luteinizing hormone / chorionic gonadotropin receptor，LHCGR)基因异常与EFS发生的关系，并对该类患者经辅助生殖助孕后治疗前景进行了讨论。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取某院生殖医学中心1例31岁女性不孕症患者，经过一系列检查女方初步诊断为：原发性不孕症、双侧输卵管周围粘连，疑为卵巢抵抗综合征。男方诊断为：原发性不育症、畸精子症。根据夫妻双方病情分析，行IVF超长方案助孕治疗，对患者穿刺取卵过程中未见卵母细胞及颗粒细胞，结合患者以前的病史，我们考虑患者可能为EFS，但是什么原因引起的患者空卵泡，是不是有可能存在某些基因异常。在取得患者同意并签署知情同意书后，我们将患者外周血送复旦大学出生缺陷研究中心，进行相关基因检测并对患者进行家系分析。

本研究的患者在实验前对本次实验目的及过程均有充分的了解，患者表示自愿参与本次实验，并签署知情同意书，符合医学伦理学要求并经伦理委员会审批通过。

1.2 研究方法 对患者进行基因检测，遗传分析和靶向基因测序使用QIAamp DNA血液迷你试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)从外周血中提取基因组DNA(QIAamp DNA Blood Mini Kit)(德国齐根市)。使用Illumina HiSeq 3000平台对患者的exome进行测序。在LHCGR中检测到c.1823T>C，p.L608P(Leu608Pro)突变。用以下引物进行Sanger测序证实该候选基因：正向引物ATGCTTGGAGGATGGCTCTT；反向引物TTTTAGTGGGCAGTGTCA。

对该患者(先证者)的亲属进行调查，了解每位亲属的生育情况，是否有与患者同类的亲属，并将家系调查结果绘成家系图进行分析。

2 结果

2.1 基因突变检测结果 患者LHCGR基因第11号外显子处，在图1箭头所指位置处存在纯合突变：chr2:48915113A>G，c.1823T>C，p.Leu608Pro，突变使LHCGR蛋白在第608位由亮氨酸(Leucine, Leu)突变为脯氨酸(Proline ,Pro)，属于纯合突变。而父母在此位点属于杂合突变，先证者弟弟(46，XY。未育)属于纯合突变，先证者妹妹(育有1女孩、1男孩)属于杂合突变(图2)。根据已有文献报道，LHCGR 基因纯合突变可导致EFS，可作为临床上EFS诊断的一个分子指标。且根据以往研究报道，具有 LHCGR 基因突变的患者较难获得卵子。本次检测结果发现患者在 LHCGR 基因上存在纯合突变，经验证符合孟德尔遗传规律。该基因纯合突变被高度怀疑是患者无卵母细胞及颗粒细胞的致病原因。

2.2 家系分析结果 对患者亲本样品的基因检测分析(图2)表明，父本和母本均为杂合突变，可生育后代；其中一位可生育后代的妹妹也是杂合子突变，而患者及其弟弟(46，XY)属于纯合突变，均未能生育后代；表明LHCGR在该位点杂合突变不影响生育后代，纯合突变患者影响生育。在一个卵泡发育正常、E2水平和血浆人绒毛膜促性腺激素(hCG)水平在正常范围内的育龄妇女中，在重复周期中不能获得卵母细胞的原因，可能是卵巢反应不良或hCG注射失败，也可能是某些基因缺陷导致。

T/C：杂合突变；C/C：纯合突变。
图2 LHCGR基因突变患者家系图

3 讨论

EFS是一种生殖障碍，尽管卵泡发育和E2水平明显正常[1]，但在进行IVF治疗过程中，对患者进行诱导排卵后反复抽吸和冲洗成熟的卵泡，也无法获取卵母细胞[2]。根据取卵当天β-hCG的水平，将EFS分为“真”EFS(GEFS)和“假”EFS(FEFS)[3]。

关于GEFS发病机制知之甚少，但可能涉及特定的遗传因素。曾有报道指出，与取回卵母细胞的患者相比，复发性EFS患者颗粒细胞中一些促凋亡基因的表达增加，其表达产物中负责正常卵泡生长的转录本(如PAPP-A，MAPK 3)明显减少[4]。Onalan等[5]曾报道了两个患有先天性耳聋的姐妹因不明原因不孕接受了三个IVF周期的病例：尽管她们卵巢反应正常，取卵时血浆hCG水平也正常，但没有取到卵母细胞或卵丘-冠状复合体。当对她们进行第二次hCG注射时依然提取不到卵母细胞。Yariz等[6]通过研究同样的两个姐妹发现在编码LHCGR的基因中发现了一个突变(p.N400S)，该突变与GEFS相关，并作为隐性性状遗传。这种突变导致了LH信号传递途径的不可逆阻断，这也解释了为什么重复给药hCG是无效的。另有研究人员提出EFS的危险因素与卵巢储备不足相似，提示EFS病因可能包括卵巢老化[7]。

LHCGR是G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor, GPCR)家族的成员[8]，主要表达在卵巢的卵泡膜细胞上，也存在于颗粒细胞(Granulosa cell, GC)和卵丘细胞(Cumulus cell, CC)上，特别是在接近排卵的优势卵泡中[9-10]。LHCGR主要通过G蛋白激活腺苷酸环化酶，增加环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate, cAMP)水平，导致PKA激活。通过蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)依赖的途径持续激活细胞外信号调节激酶(Extracellular signal regulated kinase, ERK1/2)导致卵母细胞成熟，排卵和黄体生成[11]。LHCGR主要在性腺中表达，在E2的产生、排卵和黄体形成中起重要作用。

虽然以前认为具有LHCGR突变的妇女即使通过IVF治疗，也没有使用自己的卵母细胞从而获得怀孕的机会，但最近有报道指出对该类患者进行双重扳机和延长扳机与取卵间隔时间后，获得了卵母细胞和高质量胚胎，然后进行冷冻胚胎移植，其中一患者成功地生下了双胞胎，另一患者成功产下一名男婴[19]。这些患者除了卵母细胞获取困难外，在体外受精、胚胎发育以及妊娠期均未发现明显异常。这是首次报道存在致病性LHCGR变异的妇女，通过辅助生殖技术治疗后，成功的获取卵母细胞进而获得自己的孩子，也进一步阐明LHCGR突变虽干扰排卵，但对受精和胚胎发育没有影响[19]。这也给存在致病性LHCGR变异的患者带来了新的生育希望。

致谢：感谢复旦大学出生缺陷研究中心王磊教授团队在患者血样本基因检测方面给予的帮助。