同时测定黄芩提取液中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素含量的高效液相色谱方法的建立

刘青青 王玉波 刘建伟 徐倩倩 张冉冉 王怡晴

1 滨州医学院药学院 山东 烟台 264003；2 滨州医学院附属医院胸外科；3 山东省滨州畜牧兽医研究院

黄芩为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。现代研究证明，黄芩具有抗菌、抗病毒、抗炎，提高免疫功能等药理作用，是日常使用的中药[1]。黄芩含有黄酮类、氨基酸、甾醇类、酚酸类、糖类和微量元素等[2]，其中黄酮类中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷是其发挥作用的主要活性成分[3]。黄芩苷具有清除超氧自由基的作用[4]；黄芩素能够减轻细胞膜损伤，改善神经细胞功能[5]；汉黄芩苷在保护心脑血管方面发挥着独特作用[6]。现行质量标准只有黄芩苷的含量测定，不能全面反映黄芩的质量[7]。针对黄芩及其中药制剂中黄酮类成分含量测定的报道[8-10]比较多，主要涉及药材指纹图谱[11]、质量评价[12]、饮片加工工艺[13]、不同处理方式对黄芩中黄酮类成分含量的影响[14]。采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)同时测定黄芩中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷三种成分，水与不同浓度乙醇提取液中三种成分含量的测定均未见报道。本研究建立了同时测定中药黄芩中3种主要成分含量的反相高效液相色谱法，并测定黄芩水提取液及不同浓度醇提取液中三种主要成分的含量。

1 仪器与试药

Agilent1260型高效液相色谱仪系统，包括G1379A型在线真空脱气机、G1328B型自动进样器、G1312A型四元泵、G1314F1260型VWD检测器，Agilent Chemstation型色谱工作站(美国Agilent 科技有限公司)；Agilent Eclipse XDB型C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(美国Agilent 科技有限公司)；BCD-199FD型冰箱(澳柯玛股份公司)；ALC-210.4型电子天平(广东中淮检测有限公司)；BT型电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；HH-4型数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；SB-3200PT型超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；KDW型调温电热套(山东甄城华鲁电热仪器有限公司)；RE-2000A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；501型电热恒温干燥箱(龙口先科仪器公司)；SHZ-Ш型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)。

黄芩(产自山西，批号为1611101)(山东滨州瑞丰药店)，参照《中华人民共和国药典》(2015年版)黄芩药材检测项目检测合格，药材置40 ℃干燥箱干燥12 h后备用。黄芩苷(批号为21967-41-9)、黄芩素(批号为491-67-8)、汉黄芩苷(批号为51059-44-0)(北京世纪奥科生物技术有限公司)；甲醇(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司)；磷酸(化学纯，烟台双双化工有限公司)；乙腈(色谱纯，天津市天力化学试剂有限公司)；无水乙醇(天津市天力化学试剂有限公司)。水为纯化水，LD列管式多效蒸馏水机制备。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Agilent Eclipse XDB型C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱，流动相为乙腈-0.05%磷酸水溶液(25∶75)；检测波长为275 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为10 μL；检测器为紫外检测器。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷0.003 89 g、黄芩素0.006 82 g、汉黄芩苷0.002 45 g，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，作为混合对照品储备液。精密吸取上述混合对照品溶液各1 mL，置于20 mL容量瓶中，用乙腈-0.05%磷酸水溶液(25∶75)定容至刻度，摇匀即得混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 称取黄芩约20 g，加10倍量水加热煮沸，煮沸后改温火煎煮1 h，4层纱布过滤，滤渣再加10倍量水煎煮1 h，过滤，取上清，提取3次，合并三次药液；滤液于60 ℃减压浓缩到1 g/mL，黄芩醇提取液采用20%、40%、60%、80%乙醇溶液在水浴锅中回流提取，提取程序与水煎煮相同。取20%、40%、60%、80%乙醇提取液，水提取液各1 mL分别置于25 mL容量瓶中，用乙腈-0.05%磷酸水溶液(25∶75)定容至刻度，作为供试品溶液。

2.3 专属性考察 取“2.2项下”混合对照品溶液、水提取液、20%、40%、60%、80%乙醇提取液，按2.1项下色谱条件进样，记录色谱图，见图1。黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷在混合对照品溶液、水提取液、20%、40%、60%、80%乙醇提取液的保留时间分别为10、42、22 min。结果表明，在不同提取液中，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷都具有良好的专属性，无杂峰干扰。

2.4 线性关系考察 精密量取“2.2.1项下”混合对照品溶液适量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，分别配制50、100、200、400倍稀释标准溶液，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷浓度分别为0.97～19.45，1.71～34.10，0.61～12.25 μg/mL。取1 mL过0.22 μm滤膜，精密吸取10 μL，按上述色谱条件，分别进样测定。以峰面积对应的质量浓度进行回归分析得：黄芩苷的质量浓度在0.97～19.45 μg/mL内峰面积与质量浓度线性关系良好，回归方程为y=33 754x-21.284，r=0.999 1；黄芩素在1.71～34.10 μg/mL内峰面积与质量浓度线性关系良好，回归方程为y=548 575x-6.555，r=0.999 8；汉黄芩苷在0.61～12.25 μg/mL内峰面积与质量浓度线性关系良好，回归方程为y=37 341x-8.710 4，r=0.999 6。配制并进样测定均重复5次。

2.5 精密度试验 取2.2.1项下混合对照品，按“2.1项下”色谱条件进样6次，分别记录黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷的峰面积，计算RSD分别为0.52%、0.84%，0.54%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一黄芩60%乙醇提取液6份，按“2.1项下”色谱条件进样6次，计算黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷峰面积的RSD分别为0.94%、0.52%、1.04%，均小于2%，表明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取同一黄芩60%乙醇提取液，室温下静置，分别于0、2、4、8、12、24 h进样分析，计算黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷峰面积的RSD分别为0.52%、1.06%、0.86%，均小于2%，表明样品在24 h内相对稳定。

2.8 加样回收率试验 精密量取已知含量的黄芩提取液1 mL，加入混合对照品溶液适量，按2.2.2项制成加标供试品溶液，按“2.1项下”色谱条件测定，计算回收率。黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷平均回收率分别为98.60%、98.03%和98.54%，计算RSD分别为1.99%、1.28%和2.01%，表明该方法测定结果准确可靠。

2.9 样品含量测定结果 取“2.2.2项下”供试品储备液，按“2.1项下”色谱条件，分别进样测定峰面积，用外标法以峰面积计算不同提取液黄芩中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷的含量。结果见表1。

表1 黄芩中三种化合物含量测定结果

3 讨论

分别取3种对照品适量，用流动相稀释至一定浓度，根据全波长扫描黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷，三者分别于275、277、273 nm波长处获得最大吸收峰，275 nm处对黄芩素、汉黄芩苷峰面积未显示明显影响，故本次实验将测定波长确定为275 nm。反相色谱常用的洗脱剂有甲醇和乙腈，实验过程中考察了甲醇-0.05%磷酸和乙腈-0.05%磷酸浓度作为流动相，发现甲醇做流动相没有明显的峰形，偏离基线，标准物质在规定时间内没有出峰。乙腈-0.05%磷酸洗脱能力更强，能够呈现更好的峰形，对称性好，各成分达到预期的分离效果。

实验考察了以水、甲醇、流动相分别溶解标准品和供试品溶液，检测发现水溶解对标准品和供试品色谱峰都有较大影响；甲醇溶解对标准品色谱峰影响不大，而供试品中目的峰出现偏移，色谱峰对称性不好；流动相(乙腈-0.05%磷酸)溶解时三种成分色谱峰保留时间短，色谱峰峰形好，但用流动相直接溶解标准品，溶液稳定性不好，因此标准品选用甲醇溶解制备储备液，流动相(乙腈-0.05%磷酸)作为最终稀释溶剂。

用20%、40%、60%、80%不同浓度乙醇及纯化水提取黄芩，发现不同提取液中三种成分的含量有显著差异。崔巍等[14]比较了黄芩50%、75%、95%醇提取液和水提取液中黄芩苷、黄芩素与汉黄芩苷含量，发现50%醇提取液中黄芩苷、汉黄芩苷两种成分含量最高，本研究中60%乙醇提取的黄芩中黄芩苷和汉黄芩苷含量最高，这与崔巍等研究结果相似；崔巍等发现95%醇提液中黄芩素含量最高，而本研究中水提取液中黄芩素含量最高，具体原因还有待于进一步研究。

黄芩苷60%醇提取液中含量与谢苗苗等[11]报道一致，水提、醇提液中黄芩苷含量均低于文献[12-14]报道。黄芩素含量与管仁伟等[12]报道一致，明显低于文献[11,13-14]报道。汉黄芩苷含量比文献[12-14]报道含量都要低。三种成分含量的差异可能源自药材质量的差异。

综上所述，本研究建立的测定黄芩提取液中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷含量的HPLC方法，简便准确，重现性好，灵敏度高，适合同时测定黄芩中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷的含量，可作为黄芩质量控制的参考依据。60%乙醇提取有利于黄芩苷、汉黄芩苷的溶出，水直接提取有利于黄芩素的溶出。