脐带间充质干细胞通过NR4A1调节原发性功能不全卵巢中卵泡膜间质细胞凋亡的作用研究

白兰兰 骆倩倩 刘冉冉 张洪芹

1 滨州医学院基础医学院组织学与胚胎学教研室 山东 烟台 264003；2 烟台市中心血站；3 滨州医学院基础医学院形态学实验室；4 滨州医学院烟台附属医院生殖医学科

原发性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency，POI)是指卵巢组织的功能过早衰竭，好发年龄≤40岁育龄期妇女，其特点是卵巢功能下降，促性腺激素升高，雌激素水平降低[1-3]。考虑到该疾病不仅有一系列功能损伤，而且在大多数情况下没有明确的结局，POI一词被认为比卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)更准确。在临床上，随着肿瘤发病率的增加及年轻化趋势，因化疗导致卵巢功能低下和不孕的患者日渐增多，成为 POI发病的一个重要原因[4-5]。顺铂(cis-platin，CP)是目前常用的化疗药物之一，其通过形成CP-DNA加合物从根本上限制了 DNA复制，损伤颗粒细胞、卵母细胞以及卵泡膜细胞，最终引起以卵泡闭锁、细胞凋亡为特征的卵巢衰竭[6]。近年来，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植治疗成为临床研究的热点，为POI的临床治疗提供了新的希望。但目前MSCs，尤其是脐带间间充质干细胞(umbilical cord mesenchymalstem cells，UCMSCs)对POI的作用机理研究甚少。另外，我们的前期研究证实，干细胞恢复POI的卵巢功能可能与干细胞分泌因子调控颗粒细胞凋亡有关[7]，而在卵泡发育过程中卵泡膜细胞的功能同样重要，卵泡膜细胞源性生长因子能够促进颗粒细胞的增殖和抑制颗粒细胞的凋亡[8-9]，在卵泡闭锁过程中发挥重要的调控作用，这提示卵泡膜细胞在卵巢功能调控，尤其是卵泡闭锁过程中的作用有临床实际意义。表达于各期卵泡的卵泡膜细胞孤儿核受体NR4A1在不同刺激因子作用下，主要通过磷酸化作用调节细胞凋亡。有研究表明，在多囊卵巢综合征中，NR4A1表达下调可能通过抑制凋亡或增加有丝分裂引起卵巢中小卵泡的卵泡膜细胞过度增殖[10-11]。但人UCMSCs对POI大鼠的治疗作用及卵巢中卵泡膜细胞表达的NR4A1在此治疗过程中的机制研究甚少。因此，我们以CP构建的化疗性POI大鼠模型为对象，探讨 NR4A1 在 UCMSCs治疗POI过程中的作用机制，为临床上UCMSCs 治疗POI提供实验依据，为POI患者减轻病症痛苦。

1 材料与方法

1.1 材料 5周龄雌性wistar大鼠(济南朋悦实验动物繁育有限公司)，E2、FSH ELISA 试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)，顺铂、苏木精(sigma公司)，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Roche公司)，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(BD Biosciences公司)，NR4A1抗体(proteintech公司)，SDS-PAGE配胶试剂盒(碧云天科技有限公司)，低糖DMEM培养基、McCoy’s 5A培养基、胶原酶、青霉素、链霉素(GIBCO公司)，胎牛血清(AusGeneX公司)。

1.2 CP诱导的POI大鼠模型 将5周龄雌性wistar大鼠30只随机分为对照组、POI组、POI+UCMSCs组，每组10只。对照组腹腔注射等量的0.9%生理盐水，POI组腹腔注射CP(2 mg/kg，溶于0.9%生理盐水)，注射7 d。POI+UCMSCs组待注射CP观察1周后，尾静脉注射UCMSCs悬液(1×106个/mL)。 注射1 周后，取大鼠的血清及卵巢组织进行后续的实验。

1.3 酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中雌激素(E2)、卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone，FSH)水平 将3组大鼠的血液样品4℃静置过夜，3 000 r/min离心15 min后取上清，根据E2、FSH的ELISA说明书检测各组血清中E2、FSH的水平。

1.4 苏木精‐伊红(hematoxylin-eosin)染色 将3组大鼠的卵巢组织经固定、脱水、透明、包埋、石蜡切片，制备成5 μm厚的切片，经烤片、脱蜡、苏木精及伊红染色后进行封片，并在光学显微镜下观察卵巢的形态学改变。

1.5 TUNEL细胞凋亡试剂盒检测卵巢中细胞的凋亡情况 将3组大鼠卵巢组织制备成15 μm的冰冻切片，室温过夜，根据TUNEL细胞凋亡试剂盒的说明书进行凋亡检测，并用DAPI复染细胞核，在荧光显微镜下观察卵泡膜细胞的凋亡情况。

1.6 大鼠卵泡膜间质细胞(theca-interstitial cells，TICs)的体外培养、鉴定 选用5周龄雌性wistar大鼠，4%水合氯醛麻醉后，取出大鼠的卵巢组织，在体视显微镜下用针头将卵泡刺破，使颗粒细胞流出，收集剩余组织，用5 mg/mL的胶原酶在37℃温箱消化1 h，然后用McCoy’s 5A培养液(McCoy’s 5A培养基、10%胎牛血清、1%青、链霉素)1 500 r/min 离心5 min，在6孔板中用McCoy’s 5A培养液进行离体培养。通过检测细胞色素P450c17α(cytochrome P450, family 17, subfamily A, polypeptide 1，Cyp17a1)及卵泡刺激素受体(follicle-stimulating hormone receptor，FSHR)的表达对离体培养的TICs进行鉴定[12-14]。

1.7 western blot检测NR4A1的表达变化 将TICs随机分为对照组、CP组、CP+UCMSCs组，CP组、CP+UCMSCs组分别用浓度为4 mg/L的CP，浓度为4 mg/L的CP及McCoy’s 5A培养液∶UCMSCs悬液(1×106个/mL)的体积比按照1∶1处理22 h，收集各组细胞，用RIPA裂解法分离蛋白样品，并用蛋白上样缓冲液进行处理，经过电泳、转膜、牛奶封闭等用NR4A1抗体(1∶1 000)4℃孵育过夜。次日用羊抗兔辣根过氧化物酶标记的HRP(1∶5 000)室温孵育1 h后，用Tanon 5200进行ECL曝光，并利用Image J软件进行统计学分析。

1.8 Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测CP及UCMSCs处理后TICs的凋亡情况 将TICs用CP及UCMSCs处理后，胰酶消化后收集各组的TICs，PBS洗涤2次，加入500 μL的Binding buffer将细胞重悬，加入Annexin V和FITC各5 μL，混匀。室温避光反应15 min，在1 h内进行流式细胞仪的检测。

2 结果

2.1 三组大鼠血清中E2、FSH 水平和卵巢的形态学改变 卵巢的形态学改变及血清中E2、FSH水平反映了卵巢的功能。如图1和表1、2所示，与对照组相比，POI组大鼠卵巢中各级卵泡的数目明显减少，而“类黄体样”结构明显增多，UCMSCs处理后卵巢中卵泡的数目明显增加(P<0.05)。与对照组相比，POI组血清中E2水平明显下降(P<0.01)、FSH水平升高(P<0.05)。与POI组相比，POI+UCMSCs组各级不同发育阶段的卵泡数量明显增多，血清中E2水平升高、FSH水平降低(P<0.05)。

A.三组大鼠卵巢木精‐伊红染色图像(× 100)；B. 三组大鼠卵巢中各级卵泡数目比较；C. 三组大鼠血清中E2水平比较；D. 三组大鼠血清中FSH水平比较。*P<0.05，**P<0.01。
图1 三组大鼠血清中 E2、FSH水平及卵巢形态学的改变

表1 三组大鼠卵巢中各级卵泡数目比较

注：与对照组比较，*P<0.05；**P<0.01，与POI组比较，#P<0.05，##P<0.01。

表2 三组大鼠血清中E2、FSH水平

注： 与对照组比较，*P<0.05；**P<0.01，与POI组比较，#P<0.05。

2.2 大鼠卵巢中细胞的凋亡情况 在卵泡闭锁过程中，颗粒细胞比卵泡膜细胞更容易凋亡。如图2和表3所示，三组大鼠卵巢中均有颗粒细胞凋亡的发生。并且与对照组相比，POI组大鼠卵巢中凋亡细胞的数目明显增多(P<0.01)。POI+UCMSCs组颗粒细胞凋亡的数目明显减少(P<0.01)，这提示UCMSCs能够明显减少颗粒细胞的凋亡。

A. 三组大鼠卵巢中凋亡的颗粒细胞TUNEL染色图像(400×)，绿色显示的是FITC标记的凋亡细胞，蓝色显示的是DAPI复染的细胞核；B.三组大鼠卵巢中凋亡的颗粒细胞数目比较，**P<0.01。
图2 三组大鼠卵巢中凋亡的颗粒细胞数目分析

表3 三组大鼠卵巢中凋亡的颗粒细胞数目比较

注：与对照组比较，**P<0.01，与POI组比较，##P<0.01。

2.3 TICs的形态学改变、鉴定及NR4A1的表达变化 如图3所示，对体外离体培养的TICs的形态及特异性标记分子Cyp17a1表达的观察发现，P1代TICs呈长梭形，免疫荧光和western blot结果显示TICs细胞质中Cyp17a1表达阳性，而FSHR表达阴性。另外，在TICs的细胞核中有NR4A1的表达。其中FSHR、NR4A1、Cyp17a1、GAPDH的分子量分别是78、64、50、36 kd。通过western blot对CP及UCMSCs处理后NR4A1的表达变化进行分析发现，CP处理后，TICs表达的NR4A1水平降低(P<0.01)，而CP+UCMSCs组NR4A1表达水平有所升高(P<0.05)(表4)。

A.TICs的形态观察，P1代TICs呈长梭形(200×)；B～C. 免疫荧光和western blot结果显示TICs细胞质中Cyp17a1表达阳性，而FSHR表达阴性；D～E. western blot检测CP及UCMSCs处理后TICs的NR4A1的表达变化，*P<0.05，**P<0.01。
图3 TICs的形态学特点、特异性分子Cyp17a1、FSHR的表达(400×)及CP及UCMSCs对TICs的NR4A1表达水平的影响

表4 CP及UCMSCs处理后TICs的NR4A1灰度值分析

注： 与对照组比较，**P<0.01，与CP组比较，#P<0.05。

2.4 CP及UCMSCs处理后TICs的凋亡情况 如图4和表5所示，CP处理后能够增加TICs的凋亡情况，而CP+UCMSCs组凋亡比例明显下降(P<0.01)。

表5 三组TICs凋亡细胞数目分析

注：与对照组比较，##P<0.01，与CP组比较，**P<0.01。

A～C. 流式细胞仪分别检测对照组、CP组、CP+UCMSCs组TICs各期凋亡细胞的数目；D. 三组TICs的凋亡细胞数目进行统计学分析，**P<0.01。
图4 CP及UCMSCs处理后TICs的凋亡情况

3 讨论

目前MSCs已应用于多种疾病的治疗过程中，并取得了一定的治疗效果。POI患者常因闭经或不孕进行临床就诊，目前还没有有效的方法恢复患者的卵巢功能，对患者的家庭及社会产生明显的影响。因此本研究以CP诱导形成的POI大鼠动物模型为研究对象，对UCMSCs治疗POI的治疗作用和可能的作用机制进行探讨。我们通过对CP和UCMSCs处理过的卵巢形态学改变及激素水平进行对比发现，UCMSCs能够恢复POI卵巢中的各级卵泡的数目和血清中激素水平。这提示UCMSCs能够恢复POI卵巢的功能，但其具体的作用机制尚不清楚。POI发生最重要的机制是卵泡功能障碍和以卵泡闭锁、细胞凋亡为特征的卵巢衰竭，卵泡耗竭[15]。在卵泡闭锁过程中，颗粒细胞比卵泡膜细胞更容易凋亡，颗粒细胞层在闭锁的发展期急剧减少，而卵泡膜细胞过度增生。在闭锁末期，颗粒细胞几乎消失，卵泡膜细胞被纤维母细胞取代。这提示颗粒细胞的凋亡是卵泡闭锁的首要指征，卵泡膜细胞改变是卵泡闭锁发生的重要指征。本实验中动物体内卵巢的凋亡结果显示，颗粒细胞在三组大鼠的卵巢中均有凋亡的发生，而卵泡膜细胞未发生凋亡。在动物体内卵泡膜细胞的凋亡不易被检测到，但卵泡膜细胞过度增生并被纤维母细胞取代的现象在POI卵巢中可被观察到，有研究通过masson染色发现在POI卵巢的类黄体样结构中有明显的纤维存在[16]。我们之前研究发现MSCs通过调节颗粒细胞的凋亡而发挥其治疗作用[17]。在卵泡发育过程中卵泡膜细胞的功能同样重要，卵泡膜细胞源性生长因子能够促进颗粒细胞的增殖和抑制颗粒细胞的凋亡[8,18]，在卵泡闭锁过程中发挥重要的调控作用，这提示卵泡膜细胞在卵巢功能调控，尤其是卵泡闭锁过程中的作用有临床实际意义。表达于各期卵泡卵泡膜细胞的NR4A1在不同刺激因子作用下，主要通过磷酸化作用调节细胞凋亡。非磷酸化的NR4A1 表达于细胞核，而在一些刺激信号的作用下，NR4A1 发生磷酸化，表达于细胞核和细胞质中。在其他组织发生凋亡过程中，磷酸化的 NR4A1 从细胞核移位至细胞质，定位于线粒体，与 Bcl-2 结合使其构象发生改变，与此同时，线粒体释放细胞色素 C 进入细胞质，最终胱天蛋白酶(caspase)作为细胞凋亡的标志物，通过激活其他 caspase 分子，引发一系列级联反应[19-20]。本实验的免疫荧光和western blot结果显示在TICs中有NR4A1的表达，并且经CP及UCMSCs处理后TICs表达的NR4A1水平明显发生改变。TICs经CP处理后，其细胞凋亡明显增加，并且NR4A1的表达明显下降，而UCMSCs处理明显减少了TICs的凋亡数目，其表达的NR4A1水平也有所增加。这提示TICs表达的NR4A1在POI发生以及UCMSCs治疗过程中发挥重要的作用。有文献指出MSCs通过旁分泌的作用恢复POI卵巢的功能[21-22]。因此，我们认为：UCMSCs通过旁分泌的作用，调节TICs表达的NR4A1水平，继而减少卵泡膜细胞的凋亡细胞数目，增加卵泡膜细胞对颗粒细胞凋亡的调节作用，改善POI卵巢的功能。