化浊清解愈溃煎对溃疡性结肠炎大鼠p38MAPK、TNF-α、IL-4的影响*

宋艳琦 安桂叶 侯姿蕾 刘 昊 霍永利

（1.河北中医学院，河北 石家庄 050091；2.河北中医学院附属医院，河北 石家庄 050010）

溃疡性结肠炎（UC）是一种出现于结肠和直肠的非特异性炎症性改变的疾病。UC的病变主要局限在黏膜及黏膜下层，乙状结肠和直肠是该病的主要发病部位。临床症状主要表现为黏液脓血便、腹痛、腹泻、里急后重，严重者可出现贫血、乏力等［1］。目前治疗UC的常用药物是美沙拉嗪、泼尼松、英夫利昔单抗、沙利度胺、硫唑嘌呤等［2］，这些药物治疗UC虽效果良好，但存在需要长期服药且有不能随意停药、副作用大等缺点。随着中医药的发展，中西医结合治疗UC已经成为目前的主流趋势，但是临床无统一的治疗手段。本研究从李佃贵教授的“浊毒”理论出发［3］，论证“浊毒”理论在UC发病以及治疗中的作用。本实验通过检测用药前后UC大鼠p38MAPK、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-4（IL-4）水平，探讨化浊清解愈溃煎治疗UC大鼠的作用机制，为临床应用化浊解毒法治疗UC提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级Wistar雄性大鼠50只，体质量（220±20）g，购于河北医科大学动物中心，饲养于河北中医学院研究所动物实验室，使用独立通气笼具，饲养温度为20～24℃，相对湿度为40%～60%，每天更换垫料，适度通风，使实验室保持整洁干净。

1.2 试药与仪器 1）药物。化浊清解愈溃煎，组成：黄连6 g，黄柏12 g，砂仁6 g，白头翁、秦皮、地榆、红景天、防风、大血藤、败酱草各12 g，青黛3 g，茯苓20 g，白术15 g，薏苡仁20 g，豆蔻6 g，仙鹤草30 g，三七粉2 g，木香6 g。中药为配方免煎颗粒，广东一方制药有限公司生产。美沙拉嗪肠溶片，商品名惠迪，葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司，规格0.25 g，生产批号1903。2）试剂。三硝基苯磺酸，美国Sigma公司生产。乙醚，天津市津梅化工有限公司生产。Vectastain Abc KIT，美国Vector Laboratories INC.公司生产。IL-4定量酶联检测试剂盒，上海森雄科技实业有限公司生产。TNF-α定量酶联检测试剂盒，上海森雄科技实业有限公司生产。3）仪器。酶联免疫检测仪（MK3 FC Thomer Fisher），全自动洗板机（荷兰梅里埃公司），电热恒温水箱600型（天津泰斯特），高速冷冻离心机（美国Sigma），可见分光光度计722（上海分析仪器厂），切片机RM2125（德国LEICA公司），电动玻璃匀浆机DY89-1（宁波新芝生物科技股份有限公司），显微图像分析系统HMIAS-2000（武汉千屏影像技术有限责任公司）。

1.3 分组与造模 将实验大鼠按照随机数字表法分为两组，空白组8只，其余大鼠均为造模组。采用TNBS/乙醇联合造模法［4］。造模开始前，所有大鼠禁食24 h，此间饮水不限量。造模前观察各大鼠的一般情况并记录。将5%的TNBS与50%的乙醇溶液等体积混合备用。除空白组大鼠外，其余各大鼠均先用乙醚将其麻醉，用液状石蜡将直径为0.2 cm的硅胶管润滑，将大鼠倒置，把准备好的硅胶管缓慢插入大鼠肠道7～8 cm处，按照100 mg/kg的剂量缓慢注入0.6 mL的TNBS与乙醇混悬液。注射完毕后继续倒置大鼠约30 s，以使混悬液在肠道内充分发挥作用。然后将大鼠平放于笼内，等待其自由清醒。造模完毕后所有大鼠恢复正常饮食及饮水。随机抽取2只造模大鼠处死观察结肠组织，发现大鼠结肠组织出现不同程度的充血水肿，且有糜烂以及溃疡，提示本次实验造模成功。将造模成功的大鼠随机分为5组：模型组、西药组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组，每组8只。

1.4 干预方法 空白组与造模组大鼠给予0.9%氯化钠注射液灌胃。西药组大鼠按照配置好的美沙拉嗪肠溶片混悬液（将美沙拉嗪肠溶片研碎成末后过筛，大鼠所需美沙拉嗪剂量为0.42 g/kg，将每只大鼠所需美沙拉嗪剂量溶于2 mL 0.9%氯化钠注射液中）进行灌胃。中药高、中、低剂量组大鼠按照配置好的中药混悬液（分别为22、11、5.5 g/kg，用2 mL蒸馏水冲服）进行灌胃。用药剂量折算以人与动物体型系数为计算标准［5］，各组大鼠灌胃治疗均为14 d。

1.5 标本采集与检测 药物干预结束后，再次观察各大鼠的一般情况并记录。断食不断水24 h后，断头法处死大鼠，于股动脉处取血标本4 mL，置于试管架上待凝固。将凝固好的血液标本低温离心取上清液，置于-80℃冰箱冷冻备测。1）组织观察：在取血结束后立即解剖大鼠，肉眼观察病变明显的结肠组织，将截取的组织形态描述并记录。将所截取的结肠沿肠系膜纵轴剪开，放于盛有0.9%氯化钠注射液的烧杯中冲洗，然后置于40 g/L的多聚甲醛固定液中固定。组织标本固定24 h后制作石蜡切片，经HE染色后显微镜下观察。2）大鼠血清TNF-α和IL-4的含量检测：应用上海森雄科技实业有限公司的ELISA试剂盒检测实验大鼠血清中TNF-α和IL-4的含量，严格遵守试剂盒说明书进行实验操作。微量紫外分光光度计测量样本在492 nm处的OD值，依次为基础绘制其标准曲线，并计算各组大鼠血清中相应的细胞因子含量。3）大鼠结肠组织p38MAPK的表达水平检测：取用固定在多聚甲醛固定液中的病变组织进行病理和免疫组化检测。应用免疫组化SP法检测实验大鼠病变结肠组织内的p38MAPK的蛋白含量表达。实验步骤以购买的实验试剂盒说明书为准。以胞质或胞核内出现淡黄色或棕黄色颗粒为阳性表达标志，每例标本选取40倍物镜下5个视野进行阳性细胞计数，以出现阳性细胞百分比计算出分值。采用武汉千屏显微图像分析系统，随机选择5个视野计算平均光密度值。

1.6 统计学处理 应用SPSS21.0统计软件。计量资料以（）表示，所有数据在统计前均进行正态性及方差齐性检验，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般状况 空白组大鼠精神状态良好，活动自如，体质量较其余组大鼠增长较多，皮毛光亮，大便棕黄色，质可。其余各组大鼠于造模当天即出现饮食欠佳，久卧不动，粪便不成形。至造模第4天，各造模大鼠均精神不振，蜷卧少动，体质量下降，大便质稀或伴有黏液脓血。给予药物灌胃3 d后，除造模组大鼠外，西药组、中药各组大鼠均开始逐渐活跃，饮食量慢慢增多，精神状态亦好转，皮毛开始有光泽，各项生命体征渐趋好转。中药高剂量组较其他药物干预组改善最为明显。西药组、中药中剂量组和中药低剂量组大鼠均有改善，但均不及中药高剂量组。模型组大鼠从造模开始始终精神萎靡、嗜卧少动，纳差，毛发黯淡无光泽，肛周污秽，排便质稀或有黏液脓血。

2.2 各组大鼠结肠组织肉眼观察及镜下观察 空白组组织表面平整，无肉眼可见的充血水肿、糜烂，未见溃疡形成。HE染色后镜下观察，结肠组织未见明显溃疡、纤维组织增生等，各腺体的结构未见明显异常，偶有炎性细胞浸润。模型组：肠腔变狭窄，结肠组织黏膜充血水肿及溃疡等病变，甚者可见组织表面覆白苔。经HE染色后镜下观察可见结肠组织轮廓不清，正常层次感消失，腺体结构被破坏，可见肉芽增生和纤维化改变，同时伴随有大量的炎性细胞浸润。西药组：黏膜表面瘢痕明显，稍显充血水肿，部分可见表浅溃疡。经HE染色后镜下表现为溃疡面被新生黏膜细胞覆盖，在其下层可伴纤维性修复，部分可见炎性细胞浸润。中药高剂量组：黏膜表面光滑平整，偶见表浅溃疡。病理切片HE染色后镜下观察可见病变组织多数被新生上皮细胞覆盖，溃疡面明显缩小，黏膜肌层可见大量纤维组织增生、修复等，偶见少量的炎性细胞浸润。中药中剂量组：黏膜表面略不平整，可见溃疡面肉芽组织增生。经HE染色后镜下观察可见病灶及周围被新生的黏膜上皮细胞覆盖，腺体结构轻度不规则，可见少量炎性细胞浸润。中药低剂量组：黏膜表面欠平整，可见少量的充血、水肿、糜烂等改变。经HE染色后镜下观察表现为溃疡达到肌层，较少新生黏膜细胞覆盖在溃疡面上，可见少量炎性细胞浸润和纤维性修复。

图1 各组大鼠结肠组织病理观察（HE染色，200倍）

2.3 各组大鼠血清中IL-4、TNF-α含量及结肠组织中p38MAPK蛋白表达比较 见表1，图2。模型组大鼠结肠组织中p38MAPK蛋白表达水平及血清中TNF-α含量较空白组明显升高，血清中IL-4含量降低（P＜0.05）。与模型组比较，西药组、中药高剂量组、中药中剂量组结肠组织及血清中的p38MAPK、TNF-α表达水平均有不同程度下降，而血清中IL-4的含量均有升高（P＜0.05）。经过药物治疗后，西药组、中药高剂量组、中药中剂量组的p38MAPK、TNF-α表达量降低明显，同时IL-4含量升高显著，其中尤以西药组和中药高剂量组最为显著。

表1 各组大鼠结肠组织内p38MAPK蛋白表达、IL-4、TNF-α水平比较（±s）

表1 各组大鼠结肠组织内p38MAPK蛋白表达、IL-4、TNF-α水平比较（±s）

与空白组比较，#P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组 别n p38MAPK IL-4（ng/L）TNF-α（ng/L）空白组模型组西药组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组8 8 8 8 8 8 0.312±0.021 0.402±0.048#0.325±0.019△0.333±0.022△0.341±0.031△0.385±0.023△20.007±2.928 13.982±1.836#17.435±2.928△18.870±1.592△16.070±1.823△15.052±2.899△12.689±2.99 16.771±2.515#13.404±1.982△11.446±1.412△13.195±2.162△14.734±2.797△

图2 各组大鼠结肠组织p38MAPK蛋白表达（DAB显色，苏木精复染，400倍）

3 讨论

UC是一种非特异性的炎症性疾病，目前尚无特效药［6］，病情迁延不愈并且癌变率始终处在一个逐年升高的状态［7］。UC在中医理论角度来看，属于“泄泻”“脏独”“痢疾”等范畴，主要以腹泻、腹痛、黏液脓血便等为主要临床症状［2］。国医大师李佃贵通过多年的临床实践发现UC的发生发展与浊毒有着密不可分的联系，浊毒内蕴为该病发生的关键因素，浊毒既是发病原因，又是病理产物，其贯穿整个疾病过程［8］。饮食失调、情志不畅、外邪侵袭及自身脾胃功能减退等导致水湿运化失常，水湿停聚，久则化浊，浊聚生热，热极成毒，浊毒互结于肠腑，使气血运行受阻，致血络失养，热蒸肉腑，增浊毒内蕴之势，发为本病。因此，脾胃虚弱是本病发病的基础，浊毒内蕴是病理因素［9］。治疗上要以化浊解毒、健脾和胃为根本大法。

化浊清解愈溃煎是本课题组在李佃贵“浊毒理论”基础上，结合多年临床实践总结的治疗UC的方剂，药方组成简练，临床颇有成效。方中黄连、黄柏为苦寒清热燥湿、化浊解毒之良药，可清肠道湿热之毒；砂仁芳香化浊行气，通调肠腑气机，解湿浊胶结之势，三者共为君药，黄连、黄柏、白头翁、秦皮所成之白头翁汤，则化浊解毒之力尤甚；白头翁、大血藤、败酱草、秦皮、青黛排毒之力，给邪以出路，助君药之黄连、黄柏解毒；茯苓、白术、薏苡仁、红景天、豆蔻健脾行气，助水湿健运，使浊毒无以化生，助君药之砂仁化浊，上药共为臣药。木香行气健脾止痛令肠腑气机通畅，与黄连所成香连丸，为治痢的经典方；地榆收敛止血，凉血止痢；仙鹤草活血止血止痢；三七粉行血止血且不留瘀伤正，诸药共为佐药。防风为风药，风行则祛湿化浊，为脾经之引经药，能燥湿止泻，是为使药。纵观全方，化浊与解毒并重，凉血与止痢并行，同时兼顾行气行血，谨遵“行血则便脓自愈，调气则后重自除”之宗旨。通过前期研究发现，化浊清解愈溃煎可通过调高抑炎因子IL-4的含量，抑制炎症因子TNF-α，降低p38MAPK的表达，从而抑制肠道炎症的发展。

当前，医学界认为血清细胞因子对UC有着免疫调节的作用［10］。肠道黏膜免疫功能在UC发病中起着重要作用，其所具有的免疫细胞在清除外来抗原的同时也会激活大量炎性细胞和各种炎症因子，这些炎性细胞和因子作用于肠道黏膜从而导致UC的发生［11］。本实验试图通过动物实验探究化浊清解愈溃煎对UC大鼠血清TNF-α、IL-4含量及结肠组织中p38MAPK的蛋白表达水平的干预作用，以期阐明该方药对UC的作用机制。

单核巨噬细胞是TNF-α的主要来源，TNF-α与细胞的代谢、凋亡有着密切的关系。TNF-α作为促炎因子家族中的一员，可刺激相关细胞释放，如白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）等，这些炎症因子可反过来增强TNF的生物学活性，进一步促进炎症反应［12-13］。同时，其本身具有的促中性粒细胞聚集、吞噬的作用还可诱导局部炎症反应的发生，二者产生的协同作用会进一步加重炎症反应程度［14］。大量的临床试验及动物模型实验证实UC患者TNF-α含量明显升高，与疾病活动度呈正相关［15］。

IL-4是由B细胞和T细胞产生的抑炎细胞因子，可激活肥大细胞从而诱导IgE反应，进而促进机体特异性反应，参与机体的体液免疫［16］，对TNF-α、IL-6、IL-1等促炎因子具有抑制其表达的作用。Wu等研究发现IL-4在UC患者肠黏膜中的表达要明显高于正常人的肠黏膜，重度UC患者肠黏膜病变区域的IL-4的表达量高于轻中度UC患者［17］。此前据彭小青等的相关研究发现由IL-4所诱发的辅助性T细胞2参与了UC的发生［18］。Griga等证明了IL-4在抑制UC肠道炎症反应中的作用，经检测发现UC患者外周血单核细胞产生的血管内皮生长因子（VEGF）明显减少［19］。综上，目前大多数学者认为IL-4的表达水平是评价UC病变程度的一个重要指标。

p38MAPK是一种重要的丝裂原活化蛋白激酶，其所参与的信号通路对细胞增殖、分化、凋亡以及组织炎性改变具有重要影响。正常情况下p38MAPK在肠道黏膜的表达很低，一旦其活化进入细胞核通过一系列生物和化学反应影响基因转录，会产生大量的促炎因子，如TNF-α、IL-1等细胞炎性因子［20-21］。有动物实验表明，阻断p38MAPK信号通路能有效治疗实验白鼠UC病变［22］。

综上可见，化浊清解愈溃煎对UC大鼠模型症状改善具有良好的效果，在促进溃疡愈合、改善大鼠精神状态方面甚至优于美沙拉嗪肠溶片。本实验表明化浊清解愈溃煎通过调节p38MAPK信号通路，抑制其活化，从而减少TNF-α的释放，促进炎性细胞的凋亡，同时上调抗炎因子IL-4的表达来抑制炎症反应，从而起到治疗UC的目的。p38MAPK/TNF-α/IL-4通路相关因子表达的异常是UC发生发展的重要影响因素，中药化浊清解愈溃煎可能通过该途径对UC产生作用，此次实验也为UC的临床研究提供了重要的理论基础。