温阳补心汤对慢性心衰大鼠心肌线粒体能量代谢及MAPK/PPAR-γ信号通路的影响*

王莹威 任广杰 王 博 王殿明 刘璐菲 李敬孝，△

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150036；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150036）

慢性心力衰竭（CHF）是各种心脏疾病发展到心功能受损的一种病理状态，也是导致心血管疾病患者死亡的重要原因之一。2017年6月《中国心血管病报告2016》发布［1］，目前心血管病死亡占城乡居民总死亡原因的首位，随着老龄化的进展，心力衰竭的发病率呈上升趋势。目前中医药治疗心衰具有很好疗效，中成药已被2014年中国心衰指南推荐使用［2］。CHF在中医学中属于“心痹”“心悸”“喘证”“水肿”等范畴，发病初期心气虚，逐渐发展成心肾阳虚，进而心之气血阴阳虚衰，脏腑功能失调，心失所养，气虚血瘀，水饮内停，又加重心衰。李敬孝教授基于对该病病因病机的认识，提出治疗当以温阳补心为原则。本研究以温阳补心汤干预p38MAPK/PPAR-γ通路CHF模型大鼠，探讨在促进线粒体结构改变和改善衰竭心肌能量代谢方面的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠，48只，体质量200～220 g，8周龄，黑龙江中医药大学动物中心提供，实验动物使用许可证号为SYXK（黑）2016-0035，严格遵循动物饲养规则进行统一喂养，自然光照，室温（25±2）℃。实验期间大鼠自由饮水、摄食，1周后用于模型制备。

1.2 试药与仪器 琥珀酸美托洛尔由阿斯利康制药有限公司生产（批号J20180045）。温阳补心汤：制附子10 g，白术 10 g，生姜 10 g，桂枝 10 g，黄芪 30 g，当归10 g，茯苓 15 g，益母草 20 g，川芎15 g，红花10 g（药材由黑龙江中医药大学附属第一医院中药房提供）。饮片加入清水煎煮2次，第1次90 min，第2次30 min，然后浓缩为2 g/mL煎剂。三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、氨基末端B型钠尿肽原（NT-proBNP）的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（南京卡米洛生物工程有限公司，批号分别为CEA349Ge，SFA6005AS，CEA3560Ge）；p38MAPK抗体（批号533216798）、p-p38MAPK抗体（批号00905860）、PPAR-γ抗体（批号5890623）。低温高速离心机（美国BECKMANCOULTER公司），电泳槽（HE-120型），电泳仪（北京六一仪器厂），彩色多普勒超声诊断仪（SIEMENS，探头频率为3.5）。

1.3 分组与造模 术前对48只大鼠进行多普勒彩超检测，确定心功能无异常。采用腹主动脉缩窄法制作慢性心力衰竭大鼠模型。所有大鼠术前12 h禁食不禁水，予2.5%戊巴比妥钠注入大鼠腹腔麻醉，手术板上仰卧位置麻醉，腹部剑突下正中纵向切口，分层打开腹腔，腹主动脉钝性分离，沿腹主动脉找到肾动脉分支，在此处上方约2 mm，将7号注射针头与4号可吸收手术线缝合，一起结扎，抽出针头，关腹缝合，形成腹主动脉大约50%狭窄，假手术组仅分离腹主动脉，不进行缩窄术，其他操作与模型组相同。术后将大鼠放置单笼喂养，苏醒后回笼。术后4周进行多普勒彩超检测，以左室射血分数（LVEF）＜45%判定为造模成功，排除死亡与感染，造模成功后，将CHF大鼠随机分为模型组、温阳补心汤组、琥珀酸美托洛尔组，以及假手术组12只。

1.4 给药方法 根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比值表”折算［3］，假手术组、模型组予0.9%氯化钠注射液4 mL/（kg·d）灌胃，温阳补心汤17.5 g/（kg·d）灌胃，琥珀酸美托洛尔4.27 mg/（kg·d）灌胃，各组均每日给药1次，干预8周。

1.5 标本采集与检测 1）ELISA法检测大鼠外周血中ATP、ADP、NT-proBNP的含量。给药8周后麻醉大鼠，于腹主动脉采血，具体步骤按试剂盒说明进行。2）Western blotting法检测p38MAPK、p-p38MAPK、PPAR-γ。将100 μg蛋白样品上样，SDS-PAGE电泳，电泳结束后设定转膜电流为300 mA，转膜1 h，转膜完毕后，浸入5%脱脂奶粉TBST中避光封闭1.5 h；洗涤后进入一抗稀释液中，4℃孵育过夜，次晨洗涤后浸入二抗稀释液中，室温摇床孵育1 h，孵育结束，TBST洗脱ECL显色曝光，分析结果。3）彩色多普勒超声检测大鼠心室功能。末次给药后，对大鼠充分麻醉，将其平卧固定，将探头置于胸骨左缘取左室长轴最大直径处M型超声标记室间隔与左室后壁收缩末和舒张末心内膜位置，检测左心室舒末内径（LVDD）、左心室收缩末期内径（LVDS）、左心室射血分数（LVEF）、左心室舒张末期后壁厚度（LVPWD）、左心室收缩末期后壁厚度（LVPWS），连续检测5个心动周期，取平均值。

1.6 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料服从正态分布且方差齐以（）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清中ATP、ADP、NT-proBNP含量的比较 见表1。与假手术组比较，模型组，温阳补心汤组和琥珀酸美托洛尔组大鼠外周血清中ATP的含量显著下降，ADP、NT-proBNP含量显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，温阳补心汤组和琥珀酸美托洛尔组ATP含量上升，ADP、NT-proBNP含量下降（P＜0.05）。与琥珀酸美托洛尔组比较，温阳补心汤组的ATP含量上升，ADP、NT-proBUP含量下降（P＜0.05）。

表1 各组大鼠ATP、NT-proBNP、ADP含量比较（±s）

表1 各组大鼠ATP、NT-proBNP、ADP含量比较（±s）

与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与琥珀酸美托洛尔组比较，▲P＜0.05。下同

组别假手术组模型组琥珀酸美托洛尔组温阳补心汤组n 12 12 12 12 ATP（μg/L）762.50±180.96 389.39±157.97*466.50±269.60*△583.39±273.46*△▲NT-proBNP（ng/L）25.57±9.32 82.73±21.39*65.86±19.32*△49.17±17.65*△▲ADP（μg/L）235.59±52.43 590.76±121.72*372.45±95.60*△350.20±80.36*△▲

2.2 各组大鼠心肌组织中p38MAPK、p-p38MAPK、PPAR-γ蛋白含量比较 见表2。与假手术组比较，模型组、琥珀酸美托洛尔组和温阳补心汤组p38MAPK、pp38MAPK蛋白表达水平明显升高（P＜0.01），PPAR-γ蛋白表达水平明显下降（P＜0.01），差异有显著统计学意义；与模型组比较，温阳补心汤组、琥珀酸美托洛尔组p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达水平下降（P＜0.05），PPAR-γ蛋白表达水平升高（P＜0.05）。琥珀酸美托洛尔组与温阳补心汤组比较，上述指标差异无统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组大鼠心肌组织中p38MAPK、p-p38MAPK、PPAR-γ蛋白含量比较（±s）

表2 各组大鼠心肌组织中p38MAPK、p-p38MAPK、PPAR-γ蛋白含量比较（±s）

组别假手术组模型组琥珀酸美托洛尔组温阳补心汤组n 12 12 12 12 p38MAPK 0.190±0.019 0.760±0.059*0.632±0.028*△0.419±0.037*△p-P38MAPK 0.079±0.005 0.837±0.062*0.460±0.021*△0.271±0.025*△PPAR-γ 0.793±0.042 0.248±0.017*0.460±0.021*△0.589±0.028*△

2.3 各组大鼠心室功能相关指标的比较 见表3。与模型组比较，琥珀酸美托洛尔组和温阳补心汤组LVDD、LVDS、LVEF、LVPWD、LVPWS均显著改善（P＜0.05），且温阳剂心汤组改善优于琥珀酸美托洛尔组（P＜0.05）。

表3 各组大鼠心室功能相关指标比较（±s）

表3 各组大鼠心室功能相关指标比较（±s）

组别假手术组模型组琥珀酸美托洛尔组温阳补心汤组n 12 12 12 12 LVDD（mm）6.65±0.43 9.79±0.51*8.16±0.48△7.32±0.31△▲LVDS（mm）5.60±0.39 9.57±0.62*7.18±0.42△6.56±0.36△▲LVEF（%）87.64±17.32 36.51±5.68*52.62±6.64△61.23±6.83△▲LVPWD（mm）3.25±0.36 1.97±0.27*2.16±0.39△2.73±0.25△▲LVPWS（mm）4.62±0.63 1.20±0.27*2.13±0.37△2.68±0.51△▲

3 讨 论

中医学中虽未记载“心衰”病名，根据症状可将其归于“心痹”“心悸”“喘证”“水肿”等范畴，异病同治。多认为慢性心衰的病机关键为阳虚血瘀，故治疗原则多以温阳补心为主，兼以化瘀利水［4］。心衰发病初期多为心气虚，气为血之帅，血为气之母，气虚致血液运行不畅，导致血瘀，从而加重心脏前后负荷，病程日久，心气虚加重，气虚久及阳虚，肾主相火，又称“真阳”，心主君火，相火温养君火，心肾相交，肾阳虚，则气化不利，水饮内停，发为水肿，肾主纳气，肾气充足，呼吸才能均匀，另《金匮要略》则开创性地提出了“血不利则为水”的论点［5］，《血证论》在此基础上进一步指出“血积既久，其水乃成”，由此可以推论出：心气虚致血瘀，血瘀又加重水停心下，引发出气短气不足以息、水肿、心悸等一系列症状［6］。李敬孝教授参考古文献及现代研究，经多年临床观察和总结，结合现代人饮食习惯、生活环境提出“温阳补心”的治法，运用温阳补心汤温阳补心，化瘀利水。方中诸药为真武汤合补阳还五汤加减，附子辛热，桂枝温通心阳，化饮利水，配生姜温化水气，白术茯苓以健脾利水，黄芪益气升阳，利水消肿，中、大剂量黄芪可增加心肌收缩及舒张功能，当归可以抑制心肌细胞凋亡，保护心肌细胞［7］，葶苈子、益母草通利水道，降低心脏负荷，改善心衰水肿症状［8］，川芎对心肌细胞具有保护作用，减轻缺血引起的心肌细胞损伤［9］，红花可增加冠脉血流量，改善心肌缺血［10］。诸药调配共奏温阳化瘀利水之功。

本研究采用腹主动脉缩窄法制备CHF大鼠模型，超声检测CHF模型大鼠与假手术组比较，LVDD、LVDS水平升高，LVEF、LVPWD和LVPWS水平降低，ELISA结果显示，与假手术组比较ATP表达降低，NT-proBNP、ADP表达升高，慢性心衰大鼠模型造模成功。目前已有研究证实，MAPK信号通路与慢性心衰、心肌梗死和心肌肥厚等多种心血管疾病的发生密切相关［11］。研究表明，DHF的发生常伴随有线粒体结构改变和功能损伤，引起能量合成障碍，而作为细胞能量变化感受器的MAPK，在心肌线粒体结构改变中发挥着重要作用［12］。MAPK/PPAR在机体内是重要的调控因子，可调节下游多组通路，调控细胞凋亡、能量代谢等从而影响机体内各种疾病的发生发展［13］。p38MAPK作为MAPK家族的一个成员，是细胞外信号转导的共同通路，几乎与生物体中全部病生理过程有关，尤其是炎性反应、氧化应激等细胞反应过程。p38MAPK主要在细胞质内表达，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，正常生理状况下活性较低，可调控基因表达及抗氧化损伤等［14］。p-p38MAPK转移至核内，可磷酸化激活许多转录因子，调控多类靶基因［15］。Western blotting结果显示，CHF大鼠与假手术组比较p38MAPK、p-p38MAPK表达上升，说明在CHF发生后，p38MAPK磷酸化作用过程加强，琥珀酸美托洛尔和温阳补心汤干预后p38MAPK、p-p38MAPK表达较模型组比较降低，说明p38MAPK磷酸化过程被抑制。PPAR-γ属于核因子超家族成员，为调节大量基因表达所必需的核受体［16］，研究结果显示，CHF大鼠与假手术组比较PPAR-γ表达下降，说明在CHF发生后，PPAR-γ通路被抑制，琥珀酸美托洛尔和温阳补心汤干预后，PPAR-γ表达较模型组上升，PPAR-γ蛋白被激活。

本研究表明，温阳补心汤通过抑制p38MAPK、pp38MAPK蛋白，激活PPAR-γ通路，通过参与线粒体生物合成，调节线粒体数量和质量，促进能量生成，改善心脏能量代谢，进而改善心衰进展。