加味温胆汤对急性心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌能量代谢和超微结构的影响*

张丽丽 李 雁 李 龙

（黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036）

心力衰竭是缺血性心脏病，临床主要表现为心功能障碍和呼吸困难，病理特点是心肌细胞受损和凋亡。本病迁延难愈、预后极差，发病率、致残率、病死率均处于较高水平，患者生命健康遭受严重威胁［1］。多数心血管疾病末期表现为心力衰竭，其中急性心肌梗死后心力衰竭发生率高达60%，为心衰首要病因［2］。心肌过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（PGC-1α）和心肌钙蛋白（cTnI）是心肌细胞受损的重要标志物，能灵敏反映心肌能量代谢状况，对于判断和预测心衰疗效具有积极意义［3-4］。心肌能量代谢药物曲美他嗪在治疗初期对于心梗后心衰虽具有较好的治疗效果，但后期作用不明显、预后依然较差［5］。加味温胆汤具有健脾祛痰化饮、活血祛瘀之功效，可针对心衰的病因病机对症治疗。大量动物实验结果提示加味温胆汤能从根本上改善心肌能量代谢状况和心肌超微结构，并具有疗效好、副作用少、维持时间长的优点［6-7］，但目前仍缺少对心梗致心衰病能量代谢和心肌超微结构疗效和作用机制的临床研究和动物实验。本课题组通过对HFMI大鼠模型给药治疗评估加味温胆汤对大鼠心肌能量代谢水平和心肌超微结构的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取12周龄清洁级SD雄性大鼠30只，与湖南斯莱克景达实验动物有限公司共同饲养和实验，实验前经体检所选大鼠均身体健康、心脏功能正常，预计生存期大于6个月，体质量（200±20）g。造模前适应性笼养5 d，温度（25±2）℃，湿度45%～70%，饲料符合《GB14924.3-2010》标准，饮用水为纯净水，实验周期8～10周。

1.2 实验药物

加味温胆汤，组成：法半夏、陈皮各9 g，茯苓12 g，甘草、胆星各3 g，竹茹、苍术、延胡索、丹参、川芎、赤芍各6 g，牛膝12 g，黄芪、节菖蒲各6 g。由黑龙江省中医药科学院制剂室加工而成，制作工艺为标准制干浸膏，每克干浸膏相当于生药8.62 g。曲美他嗪片（瑞阳制药有限公司，国药准字H20066534）。

1.3 试剂与仪器

氯化钠（分析纯，CAS：7647-14-5，江苏科伦多食品配料有限公司）；苯巴比妥注射液（福建省闽东力捷迅药业有限公司，国药准字H20057384）；青霉素注射液［石药集团中诺药业（石家庄）有限公司，国药准字H13021632］。大鼠cTnI、PGC-1α酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒分别购自广锐生物和上海沪震生物科技有限公司；10%甲醛溶液（南京化学试剂股份有限公司）。Varioskan LUX多功能酶标仪：赛默飞；LS-20ECG动物心电图记录分析仪（北京拜安吉科技有限公司）；S5兽用B超机［大为医疗（江苏）有限公司］；JIDI-4D-WS离心机（广州吉迪仪器有限公司）；奥林巴斯生物显微镜CX43（上海）；HX-300S小型动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司）；Leica RM2235石蜡包埋切片机（徕卡）；大小鼠脉搏血氧呼吸监护仪（玉研仪器）；Latheta LCT 200小动物CT机（日立阿洛卡）；BSA124S天子天平（赛多利斯）；-80℃超低温冰箱（Thermo公司）。

1.4 模型制备

选取大鼠30只，采用随机数表法分为两组，每组15只。造模组通过手术结扎冠状动脉左前降支建立急性心肌梗大鼠死模型：以40 mg/kg剂量腹腔注射2%苯巴比妥溶液麻醉大鼠，手术取仰卧位，术前在大鼠颈、胸部常规消毒、备皮，于大鼠心脏端连接Ⅱ导联心电图监测心电指数，从颈部开始，沿气管术方向做3 cm纵切口，钝性分离颈部肌肉组织，暴露气管后插管，连接呼吸机；用无创性线结扎冠状动脉左前降支（LAD），以结扎部位远端心肌变白、心搏减弱、心电图出现ST段弓背抬升为急性心肌梗死成功标志。假手术组完成穿刺但并未结扎左前降支。两组操作完成后排净胸腔气体，缝合切口并消毒，术后肌肉注射20万U青霉素预防感染。术后饲养72 h，对两组大鼠进行心衰评分，若结扎造模组大鼠符合Framingham慢性心衰诊断标准证明造模成功，两组大鼠术后心衰评分结果见表1。假手术组作为筛选造模组所用的对照组，不计入后续分组研究。

表1 两组大鼠术后72 h Framingham慢性心衰评分结果比较（分，±s）

表1 两组大鼠术后72 h Framingham慢性心衰评分结果比较（分，±s）

符合两项主证或主、次证各1项或次证超过3项，Framingham评分大于1.5分

组别造模组假手术组n 2～3分 ＞3分15 15 0～1分0 12 1.5～2分10 3 5 0 0 0

1.5 给药方法

术后72 h将造模成功的15只大鼠随机分为3组，各5只。模型对照组给予生理盐水4 mL/kg灌胃，每日1次；曲美他嗪组给予曲美他嗪溶液10 mg/kg灌胃；中药组加味温胆汤10 mg/kg灌胃。每日9∶00～10∶00间灌胃给药，持续4周，每周对大鼠称体质量。

1.6 标本采集与检测

1.6.1 大鼠心功能检测 分别在给药前（术后72 h）、给药后4周采用小动物多普勒彩超对3组大鼠的心功能指标进行测量。腹腔注射2.0%苯巴比妥进行麻醉，仰卧位固定，于大鼠左胸前乳头肌前对左室进行扫描，探头频率7～15 MHz，测量左室舒张末容积（LEDV）、左室收缩末容积（LES），左室射血分数（LVEF）=（LEDVLES）×100%/EDV，即大鼠每搏输出量占心室舒张末期容积量的百分比，LVEF正常值＞50%。

1.6.2 大鼠心肌能量代谢因子检测 在给药前（术后72 h）、给药后4周，麻醉大鼠并在鼠尾静脉抽取静脉血2 mL，3 000 r/min离心10 min，将血清标本置于-80℃超低温冰箱冻存待测。按照试剂盒说明书，应用双抗夹心法测定大鼠心肌能量代谢因子（血清cTnI、PGC-1α）的浓度，利用酶标仪测定OD（吸光度值）并利用标准曲线计算出血清蛋白浓度，检测波长为450 nm。

1.6.3 大鼠心肌超微机构完整性（MUS）评分方法 在第4周末次给药后采血，腹腔注射2%苯巴比妥溶液麻醉大鼠，快速开胸腔、剪开心包，取出心脏，用生理盐水溶液反复冲洗心脏至溶液变清无血液，将心脏浸入10%甲醛溶液中，经横断面剔除心脏左室中部组织经脱水、石蜡包埋、修片、切片、裱片、烤片后进行HE染色（核染）和Masson染色（纤染），染色后心肌细胞核呈蓝褐色，胶原纤维呈蓝色。心肌超微结构完整性评分：1分为心肌细胞排列整齐，心肌小动脉周围及心肌细胞间隙可见少许胶原纤维；2分为心肌结构正常，但心肌胶原增多；3分为心肌细胞轻微水肿，心肌胶原少量沉积于心肌组织、小动脉附近；4分为心肌细胞肥大、排列紊乱，心肌组织及小动脉周围有较多胶原沉积，并有向心肌细胞间隙伸展的趋势。

1.7 统计学处理

应用SPSS23.0软件对研究资料进行统计学分析，组内两组资料配对比较采用单因素方差分析，组间计量资料（）配对比较采取t检验，计数资料（%）做χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组HFMI大鼠心功能比较

见表2。治疗后，中药组和曲美他嗪组大鼠心功能指标LVEF、LES增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；且治疗后中药组LVEF高于曲美他嗪组，LES低于曲美他嗪组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组HFMI大鼠LVEF、LES数值比较（%，±s）

表2 各组HFMI大鼠LVEF、LES数值比较（%，±s）

与模型对照组治疗后比较，*P＜0.05；与曲美他嗪组比较，△P＜0.05。下同

组别 时间LVEF LES中药组（n=5）曲美他嗪组（n=5）模型对照组（n=5）治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后54.39±4.18 75.26±5.27*△54.28±4.24 66.89±5.06*54.43±4.26 47.18±4.49△24.37±4.12 35.25±5.22*△24.28±3.54 46.56±5.01*24.46±3.78 37.75±4.46△

2.2 各组HFMI大鼠心肌能量代谢指标比较

见表3。治疗前，3组大鼠血清cTnI、PGC-1α水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗4周后，中药组、曲美他嗪组大鼠血清cTnI、PGC-1α水平均较治疗前显著降低（P＜0.05），模型对照组上述指标水平则与治疗前相比有提升，但差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后中药组大鼠血清cTnI、PGC-1α水平均低于曲美他嗪组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组HFMI大鼠血清cTnI、PGC-1α水平比较（±s）

表3 各组HFMI大鼠血清cTnI、PGC-1α水平比较（±s）

组别中药组（n=5）曲美他嗪组（n=5）模型对照组（n=5）时间治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后cTnI（μg/L）65.64±4.02 54.23±3.27*△65.56±4.17 59.55±3.85*65.61±4.11 67.89±3.96△PGC-1α（ng/mL）8.17±1.24 4.28±0.75*△8.24±1.08 6.36±0.82*8.21±1.19 9.02±2.02△

2.3 各组HFMI大鼠心肌超微结构比较

见表4，图1～图2。治疗4周后，各组大鼠血清MUS比较差异具有统计学意义（P＜0.05）：中药组＜曲美他嗪组＜对照组。

表4 各组HFMI大鼠心肌超微结构完整性评分比较（分，±s）

表4 各组HFMI大鼠心肌超微结构完整性评分比较（分，±s）

组别n 5 5中药组曲美他嗪组1 2 MUS 5模型对照组.28±0.25△.43±0.36*3.56±0.32△

图1 各组大鼠治疗4周后心肌组织形态学（HE染色，100倍）

图2 各组大鼠治疗4周后心肌组织形态学（Masson染色，100倍）

3 讨 论

急性心肌梗死、心肌炎、高血压病、高脂血病、糖尿病等心血管疾病均能诱发心力衰竭（心功能障碍），其中急性心肌梗死导致的心力衰竭占60%～70%，是最为主要的病因，这与急性心肌梗死可对心肌细胞造成严重损害，继而引发心肌能量代谢紊乱、心肌超微结构发生改变有密切关联［10-12］。大量研究提示，线粒体是参与心肌能量代谢的重要细胞器，可生成关键调控因子PGC-1α，一方面，PGC-1α参与糖脂能量代谢，可维持血氧供应正常水平、抑制能量代谢紊乱，但PGC-1α浓度过高可诱发糖脂代谢紊乱［13］；另一方面由PGC-1α主导的信号调控通路也有助于修复和保护心肌细胞、血管内皮细胞，从而有效预防心室重构、减少再灌注损伤。此外，cTnI水平变化对于心肌损伤极为敏感（特异性达91%、敏感性达100%）［14］，cTnI水平升高可提升心肌损伤，且数值越高，损伤越大。上述两项指标均有助于反映心肌能量代谢和心肌超微结构。针对上述病因机制，西医从优化心肌能量代谢入手应用了一些西药，取得了不错的成果，如曲美他嗪就是一种能够优化心肌能量代谢的药物，该药有助于抑制氧化应激、抑制心肌细胞凋亡。但临床数据显示，应用曲美他嗪治疗心力衰竭虽然能够在治疗初期（大鼠心衰后1～2周）取得较大进展，但在后期（大鼠心衰后4～6周）的疗效不够明显，特别是对于心肌超微结构的改善不足，这也说明还要继续寻找更加安全有效的用药方案。

中医学将心力衰竭归为“心痹”“心水”“心咳”范畴，认为情志不调、饮食不节为外因，心肾阳虚和气滞血瘀为内因。加味温胆汤具有健脾祛痰化饮、活血祛瘀之功效，可针对心梗后心衰患者的病机病因对症治疗。从组方上分析，茯苓归心、肺、脾、肾经，可利水渗湿、健脾宁心，为君药，主治肺水肿、心悸、胸闷气喘、失眠、烦躁，法半夏辛温，燥湿化痰，和胃止呕；臣药竹茹、陈皮、枳实，竹茹甘而微寒，清热化痰，除烦止呕。茯苓健脾渗湿，杜生痰之源；生姜、大枣协调脾胃，生姜兼制法半夏毒性。使药甘草协调诸药。归纳全方，法半夏、陈皮、生姜偏温，竹茹、枳实偏凉，温凉兼进，令全方不寒不燥，理气化痰以和胃，胃气和降则胆郁得舒，痰浊得去则胆无邪扰，如是则复其宁谧，诸症自愈。现代药理研究则表明，加味温胆汤中富含黄酮类、多糖类、皂苷类、生物碱类等化合物，其中甘草的甘露醇具有利尿功效；多糖类化合物可降压降糖、调节免疫力；皂苷和黄酮类成分则具有止咳、祛痰、平喘、抗菌、护肝的药理活性。此外，从生物学角度，加味温胆汤治疗心衰的机制还包括β淀粉样蛋白（Aβ）清除与抗神经炎症、调控脂质代谢和胰岛素抵抗、保护心肌细胞、促进心肌重构和调节水电解质平衡等。

本次动物实验的结果也显示，治疗后中药组大鼠心功能指标（LVEF）、心肌能量代谢因子（血清cTnI、PGC-1α）的改善水平差异具有统计学意义：中药组优于曲美他嗪组，曲美他嗪组优于对照组。此外，治疗4周后，各组大鼠心肌超微结构完整性评分比较差异也具有统计学意义：中药组＜曲美他嗪组＜对照组。表明加味温胆汤对急性心肌梗死后心力衰竭大鼠的心肌能量代谢具有促进作用，对心肌超微结构的完整性具有保护作用，并能有效改善大鼠的心功能，较曲美他嗪等西药具有优势，值得进一步进行临床试验。