电刺激对脊髓损伤大鼠神经再生及NRG-1/ErbB-PI3K/Akt通路的影响*

王 倩 朱 薇

（1.空军军医大学西京医院，陕西 西安 710033；2.西北大学附属第一医院，陕西 西安 710002）

脊髓损伤可导致原发性机械损伤、继发性神经细胞凋亡、反应性神经胶质增生和轴突无法再生。由于受损脊髓的无反应环境，不会发生轴突再生［1-2］。脊髓损伤后功能的丧失可能来自主要的机械损伤和随后的多方面的二次退行性反应［3］。近年来，研究证明受损的脊髓功能可以恢复。电刺激被用作促进神经系统损伤和疾病后功能恢复的治疗工具。电刺激的临床应用的实例包括用于恢复听力的耳蜗植入物，用于恢复呼吸和手掌握的下运动神经元的刺激，以及用于治疗帕金森病症状的深部脑刺激［4］。电刺激也被用于抵消与麻痹相关的失用性萎缩。电刺激在脊髓损伤患者的临床环境中已得到应用。研究脊髓损伤患者电刺激的实际益处包括：肌肉质量增加、骨密度改善、心血管功能增强、改善肠功能、减少痉挛、膀胱感染率降低。神经调节蛋白（NRG1）是ErbB受体的配体家族，其可明显刺激中枢神经系统培养细胞生长能力［5］。NRG1在多种内皮细胞中高表达，包括：培养的人脐静脉内皮、人冠状动脉和心内膜内皮，以及来自成年大鼠心室的冠状微血管内皮。研究证实，NRG1在脊髓神经元中高表达，NRG1与ErbB的结合诱导其自身及其共同受体ErbB的磷酸化［6-8］。NRG1/ErbB信号通路在神经信号通路信号传导中发挥重要作用，调节神经细胞功能，包括抗凋亡和血管生成反应。既往研究表明NRG1过表达对培养的神经细胞具有PI3K/Akt依赖保护作用［9］。本研究拟探讨电刺激对脊髓损伤大鼠神经再生及NRG1-ErbB-PI3KAkt通路的影响，探讨脊髓损伤的分子机制，为脊髓损伤的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD大鼠60只，雌雄各半，12周龄，体质量（200±20）g，空军军医大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（陕）2017-0005。动物使用许可证号：SYXK（陕）2018-0012。

1.2 试剂及仪器 TrizolTM试剂（美国Invitrogen公司，批号69874）；TaqManTMmiRNAs Assay试剂盒（美国Applied Biosystems公司，批号32417）；RNeasy Mini Kit试剂盒（德国Qiagen公司，批号ab4063）；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒（宝日医生物技术（北京）有限公司，批号180326）；Ultra SensitiveTMS-P试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司，180128）；NRG1、ErbB、PI3K、Akt一抗（1∶100，武汉博士德生物工程有限公司，批号：604315、602317、602346、607125）；二氨基联苯胺（DAB）、苏木精溶液（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，批号30625、30419）。XE-98 MEP仪器（美国Axon公司）；安捷伦Mx3000P实时荧光定量PCR仪（安捷伦科技（中国）有限公司）；组织冷冻培养基（美国热电公司）；CM1850低温恒温器（德国徕卡）；振荡电场刺激器（中国科学院电气工程研究所）。

1.3 模型制备 将大鼠随机分成3组：对照组、模型组、电刺激组，每组20只。模型组、电刺激组测量大鼠的初始体质量，然后腹膜内注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g体质量）麻醉大鼠，用胶带将每只大鼠的四肢和头部固定在手术台上，然后用3%碘溶液对皮肤进行消毒。在T10棘突的中心沿着背部的中线进行纵向切口，长度约为2 cm，然后将组织层切开以显示T9～T11薄层和棘突，用微型剪刀切割 T9～T11棘突，小心地提起T10椎板以避免撕裂肋骨并损伤血管，随后暴露T10脊髓，然后将大鼠固定在大鼠脊髓减重装置上，通过使10 g金属棒从5 cm的高度自由落到大鼠的脊髓上诱导脊髓损伤，当大鼠的脊髓被击中时，大鼠的尾巴或后腿抽搐。诱导脊髓损伤后，电刺激组振荡电场刺激器的两个电极用不可吸收的缝合线固定在T9和T12棘突的两侧，然后逐步移除切口缝合线，术后每日腹腔注射100 000单位的青霉素，连续3 d，以防止感染。诱导脊髓损伤大鼠每天被动排尿2～3次，直到建立自动排尿，在被动排尿时，用左手抬起腹部，用右手搜寻填充的膀胱，一旦定位，膀胱从底部被挤压，直到尿液逐渐排出，会阴部保持干燥以防止感染。

1.4 干预方法 术后第3天使用振荡电场刺激器对电刺激组给予电刺激治疗，振荡电场刺激器设置参数为：强度为40 μA，脊髓上的电场强度为400 μV/mm，振荡周期的持续时间为15 min。每日1次，连续7周。

1.5 机械痛阈（PWT）及热刺激潜伏期（PWTL）的测定 各组大鼠处死前，将大鼠置于透明观测盒里，用秒表计时，从大鼠后足与托盘接触到出现踮脚、回缩、舔足、挣扎记为大鼠的热刺激缩足反射潜伏期，测定PWT、PWTL［10］。

1.6 脊髓损伤的行为学评分（BBB）及运动诱发电位（MEP）的测定 BBB评级是评估脊髓损伤大鼠运动功能最常用的评估方法之一，分为21个等级。它还用于观察后肢活动，包括后肢每个关节活动的数量和范围，支撑身体的能力，以及前肢和后肢之间的协调。此外，它可以分为早期运动强度，中期协调，晚期精细活动。在BBB评级完成后，将所有组中的大鼠麻醉，然后通过使用MEP仪器检测MEP，将两对刺激针电极放置在T7/8和L1/2椎板之间的间隙附近，正电极指向前部，负电极指向后部。两个电极之间的距离范围为0.5～0.8 cm，设定以下参数：脉冲宽度0.05 ms，输出强度100～150 V。然后将电极置于腓肠肌的两侧，记录复合肌肉动作电位作为最终值。

1.7 脊髓组织NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表达水平的测定 用Trizol试剂从脊髓中分离总RNA，使用Taqman miRNA逆转录试剂盒逆转录，并使用Taq-ManTMmiRNAs Assay试剂盒进行实时PCR，重复实验3次。将NRG1、ErbB、PI3K。kt表达标准化为U6，重复实验3次，使用RNeasy Mini Kit试剂盒从脊髓组织分离的总RNA用随机六聚体和Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行逆转录。NRG1、ErbB、PI3K、Akt引物如下：NRG1 正向：5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′，反向：5′-TCACGCCACAGTTTCCC GGA-3′。ErbB 正向：5′-ATTCGTAGAGGATTGACG-3′，反向：5′-AACTGCTACAGTTTTCCGTAT-3′。PI3K正向 ：5′-CCTAGGACTTGCTTA-3′，反 向 ：5′-CCTAAGCACAGTCCTGACTG-3′。Akt正 向 ：5′-CGTAGCTACTCCTGGGA-3′，反 向 ：5′-CCTGACTGACACAGT CCTGGGACCT-3′。U6 正向：5′-CGCCTAGTCCTGGG AATGA-3′，反向 ：5′-CCTAGTAGGTACACAGTCCTGGCCTGAGA-3′。热循环：1个循环，94℃，3 min；30个循环，94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，68 ℃ 90 s；然后是72 ℃10 min。获得 Ct值，并使用 2-ΔΔCt的方法计算相对表达，根据下式进行计算：ΔCt（靶基因）=Ct（靶基因）-Ct（参考基因）。

1.8 脊髓组织NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表达水平的测定 试验结束后，通过腹膜内注射10%水合氯醛麻醉大鼠，暴露胸部，用0.9%氯化钠注射液连续灌注肝脏的顶点直至颜色变白。将组织用4%多聚甲醛灌注30 min并在4%甲醛中固定12 h后，取出位于末端附近1 cm处的受损脊髓和脊髓组织，然后将切片包埋在最佳冷却温度组织冷冻培养基中，通过低温恒温器将冷冻切片横向切片，厚度为10 μM。待定免疫组织化学超敏性Ultra SensitiveTMS-P试剂盒制备FFPE组织切片。在二甲苯中脱蜡并在一系列分级醇中再水合，将切片热固定并阻断过氧化物酶活性，与蛋白质封闭溶液一起温育。随后将切片与针对NRG1、ErbB、PI3K、Akt的抗人兔Mobility抗体一起温育，接着与二抗温育。二氨基联苯胺（DAB）用作色原体，切片用苏木精溶液复染，脱水并固定，使用双盲法评估所有载玻片，对于每个切片，选择5个高倍视野（400倍）并在每个视野中计数100个细胞，将染色强度和阳性面积百分比组合以解释FOXP3和TLR4免疫组织化学反应性；如下，染色强度：0=无染色，1=灰色，2=黄色，3=棕色；阳性区域：0表示≤5%，1表示 6%～25%，2表示26%～50%，3表示51%～75%，4表示＞75%。将染色强度和阳性面积的值相乘以得到最终得分，0～2的评分为阴性，3～4为弱阳性，6～8为中度阳性，9～12为强阳性。

1.9 统计学处理 应用SPSS23.0对数据进行录入、统计学分析。计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠PWT、PWTL、BBB、MEP潜伏期评分比较 见表1。与对照组比较，模型组PWT、PWTL、BBB评分水平降低，MEP潜伏期升高（P＜0.05）；与模型组比较，电刺激组PWT、PWTL、BBB评分升高，MEP潜伏期降低（P＜0.05）；与对照组比较，电刺激组PWT、PWTL、BBB评分水平略微降低，MEP潜伏期略微升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠PWT、PWTL、MEP潜伏期及BBB评分比较（±s）

表1 各组大鼠PWT、PWTL、MEP潜伏期及BBB评分比较（±s）

与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同

组 别n PWT（g）PWTL（S）BBB评分（分）MEP潜伏期（ms）对照组模型组电刺激组20 20 20 36.14±6.12 12.65±6.36*35.32±5.19△21.34±3.45 7.86±2.98*20.77±3.34△20.13±3.95 8.54±2.39*18.54±2.69△6.24±1.36 52.36±6.85*7.00±3.24△

2.2 各组大鼠脊髓神经结构的比较 见图1。对照组脊髓神经结构正常、脊髓神经元细胞完整；模型组脊髓中心灰质区见小片状被破坏，白质内大量体积小囊泡形成，呈虫蚀样改变；电刺激组白质内大量体积小囊泡数目减少，脊髓神经结构趋于正常，小片状被破坏面积减少。

图1 各组大鼠脊髓神经结构（HE染色，400倍）

2.3 各组大鼠脊髓组织NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表达水平比较 见表2。与对照组比较，模型组NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表达水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，电刺激组NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表达水平升高（P＜0.05）；与对照组比较，电刺激组NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表达水平略微降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠脊髓组织NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠脊髓组织NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表达水平比较（±s）

组别对照组模型组电刺激组n 20 20 20 NRG1 mRNA 1.79±0.13 0.85±0.14*1.58±0.13△ErbB mRNA 2.15±0.18 1.54±0.13*1.98±0.13△PI3K mRNA 1.76±0.17 0.98±0.12*1.58±0.17△Akt mRNA 1.94±0.11 0.56±0.13*1.73±0.18△

2.4 各组大鼠脊髓组织NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表达水平比较 见表3，图2～图5。与对照组比较，模型组NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，电刺激组NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与对照组比较，电刺激组NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表达水平略微降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。免疫组化法下，NRG1、ErbB、PI3K、Akt阳性表达为棕褐色，NRG1、ErbB、PI3K、Akt阳性表达情况与各蛋白表达水平符合。

表3 各组大鼠脊髓组织NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表达水平比较（ng/g，±s）

表3 各组大鼠脊髓组织NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表达水平比较（ng/g，±s）

组别对照组模型组电刺激组n 20 20 20 NRG1 236.54±14.63 86.65±19.96*200.63±16.98△ErbB 187.96±16.65 103.65±19.96*169.65±17.63△PI3K 183.67±15.63 71.14±16.78*180.73±13.65△Akt 145.77±6.46 67.86±6.98*143.45±6.98△

图2 各组大鼠脊髓区NRG1蛋白表达（DAB染色，400倍）

图3 各组大鼠脊髓区ErbB蛋白表达（DAB染色，400倍）

图4 电刺激对大鼠脊髓区PI3K蛋白表达水平（DAB染色，400倍）

图5 各组大鼠脊髓区Akt蛋白表达（DAB染色，400倍）

3 讨 论

电刺激对脊髓损伤患者有益，失去下肢功能的脊髓损伤患者由于动态能力有限，可能会出现明显的肌肉萎缩和一般健康状况下降，通过神经肌肉电刺激，这些个体的瘫痪肢体可以被诱导产生运动和力量，电刺激可增强脊髓损伤患者站立、划船、踩踏、伸展和行走的能力。越来越多的证据表明，电刺激可以促进损伤后的外周和中枢神经系统修复［11］。在大鼠股神经横断和修复的模型中，电刺激促进运动神经元的脑源性神经营养因子（BDNF）释放并增强穿过远端神经残端的优先运动神经再支配，这种刺激范例也促进了股神经修复后的功能恢复［12-13］。本研究结果显示，模型组PWT、PWTL、BBB评分水平降低，MEP潜伏期升高；与模型组比较，电刺激组PWT、PWTL、BBB评分升高，MEP潜伏期降低；与对照组比较，电刺激组PWT、PWTL、BBB评分水平略微降低，MEP潜伏期略微升高。这与上述研究结果符合，同时提示电刺激能减轻大鼠脊髓损伤程度，促进损伤神经再生。结合损伤脊髓病理结果，对照组脊髓神经结构正常、脊髓神经元细胞完整；模型组脊髓中心灰质区见小片状被破坏，白质内大量体积小囊泡形成，呈虫蚀样改变；电刺激组白质内大量体积小囊泡数目减少，脊髓神经结构趋于正常，小片状被破坏面积减少。这提示电刺激能恢复受损脊髓结构，减轻脊髓损伤。

NRG1是一种特定的生长因子，其在轴突表面表达，与ErbB受体酪氨酸激酶结合由施万细胞表达，并作为髓鞘形成的触发分子，因此，NRG1/ErbB信号传导的强度决定施万细胞是否产生髓鞘以及产生多少髓鞘［14-15］。由于少突胶质细胞也对NRG1有反应，因此在神经系统中少突胶质细胞介导的髓鞘形成过程中可能存在这种NRG1/ErbB信号传导机制，NRG1通过与ErbB3或ErbB4结合而发挥作用；然后，每种受体与ErbB2异二聚体化，ErbB2不能直接结合NRG1，但具有活性激酶结构域。施万细胞主要表达ErbB2和ErbB3，但少突胶质细胞以发育调节的方式表达所有3种ErbB受体［16-18］。已显示该信号传导在髓鞘形成过程中调节髓鞘形成的施万细胞的形态和基因表达。在神经系统中，NRG1/ErbB信号传导涉及广泛的过程，包括神经元迁移，轴突寻路和突触可塑性。体外研究表明［19］，这种信号传导影响少突胶质细胞的表达，分化，髓鞘形成和存活。研究表明［20］，PI3K/AKT通路激活通过调节抗凋亡和自噬反应在脊髓损伤中起着重要的神经保护作用。Akt磷酸化可削弱神经细胞凋亡相关下游分子的表达，如裂解的Caspase-3、6、9，Bcl-2和Bax，导致Bcl-2/Beclin-1复合物的解离，该过程释放Beclin-1并导致自噬反应。PI3K激酶抑制剂LY294002可阻断了自噬体形成，PI3K/AKT途径的激活可抑制脊髓损伤后的细胞凋亡。本研究结果显示，与对照组比较，模型组NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA、蛋白表达水平降低；电刺激组NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA、蛋白表达水平较模型组升高，同时与对照组比较无明显差异。这提示电刺激可促进NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA、蛋白的表达诱导脊髓损伤大鼠神经再生。

综上所述，电刺激能减轻大鼠脊髓损伤程度，促进损伤神经再生；其机制与电刺激激活NRG1-ErbBPI3KAkt通路，促进 NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA、蛋白的表达有关。