紫海胆急性毒性试验方法标准化探讨

赖素群, 余露军, 吴美慧, 曾 进, 李建军

(广东省实验动物监测所, 广东省实验动物重点实验室, 广州510663)

由于工业三废、城镇生活垃圾、农业养殖使用的化肥、农药和禽畜粪便、海洋油气开采、运输船舶排放、海上事故、近海养殖等污染，我国渤海、东海和黄海等海域的生态系统大部分处于亚健康、甚至不健康的状态，而且还有进一步恶化的趋势[1]。环境污染常是多来源、多种类的复合污染，存在拮抗、叠加或协同作用，生物测试可综合多种有毒物质的相互作用，判定有毒物质的质量浓度和生物效应之间的直接关系，为水质的监测和综合评价提供科学依据[2]。筛选合适的海洋污染评价生物、建立标准化毒性试验方法是目前我国亟待解决的一个问题。

海胆具有个体相对小、生命力强、适应性广，在实验室控制条件下容易饲养、繁殖周期相对短、能分批产卵或连续产卵和产卵量大等特点，日本、加拿大、新西兰和美国等国家已广泛采用海胆监测海洋环境的污染状况[3,4]，我国海胆毒性试验也开展较多[5-7]，海胆已成为海洋生态毒理学研究的模式生物。

紫海胆(Anthocidaris crassispina)属棘皮动物门，海胆纲，正形目，长海胆科，紫海胆属。普遍分布在我国浙江、福建和广东各地海岸及日本南部沿海，栖息在浅海的岩礁砂石海底[8]，营养丰富，药用价值高，是我国东南沿海重要的经济品种[9]。

海胆毒性试验受试对象包括胚胎[5]、浮游幼虫[6]、幼(稚)海胆[7,10]、成海胆[11]等，其中胚胎期和幼虫期是海胆生命中对污染物最敏感的时期，美国材料与试验协会(ASTM)于1995年制定《用海胆纲胚胎做静态剧毒试验的标准指南》，并于1998年、2003年、2012年修订。胚胎毒性试验观察指标包括致死率、致畸率、生长发育速度等，对实验操作人员的技术要求较高。而海胆浮游幼虫急性毒性试验方法比较简单，可能具有较好的应用前景。

试验方法的标准化是决定毒理学安全性评价结果是否可靠的关键所在。影响毒性作用的因素包括毒物因素、机体因素与环境因素三个方面。参比毒物试验可以评估受试生物对毒物的敏感性、试验条件、试验的适合度, 为实验室内和实验室间数据比较提供了一个质量控制标准[12]，也可评估毒性试验的稳定性和准确性[13]。本研究采用的重铬酸钾[14]、硫酸锌[15]、3,5-二氯苯酚[16]、十二烷基硫酸钠(SDS)[17]为国际上广泛认可和推荐的参比毒物，以降低毒性试验条件优化过程中毒物因素的影响。本文在其它机体、环境因素近似的条件下(如实验幼虫来自同一对亲胆，水质因子、饵料和投喂量等基本一致)，研究水温和适宜毒性试验的起始日龄等影响紫海胆急性毒性试验结果的关键因子，以期为紫海胆毒性试验方法的标准化提供依据。

1 材料与方法

1.1 紫海胆

紫海胆亲本来源于惠州大亚湾，实验室驯养2个月以上。用注射器将1～3 mL 0.5 mol/L的氯化钾溶液由围口膜注入亲胆，将亲胆反口面向下放置于盛满过滤海水的烧杯上，使海水淹盖生殖孔，收集排放的精卵人工授精，洗卵3～5次，移入幼虫养殖缸培育。

1.2 试剂与仪器

重铬酸钾(K2Cr2O7，含量≥99.8%，分析纯，广州化学试剂厂)、七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O，含量≥99.5%，分析纯，广州化学试剂厂)、3,5-二氯苯酚(98.15%，分析纯，上海麦克林生化科技有限公司)、十二烷基硫酸钠(SDS，含量≥99.0%，美国Sigma进口分装)。

电子天平(ME204E)购自梅特勒-托利多公司，显微镜(莱卡DM1000)购自德国莱卡公司，电导率仪(梅特勒SG3)、pH计(梅特勒-托利多SG2)购自梅特勒-托利多公司，溶氧仪(YSI 550A-2) 购自美国YSI公司，人工气候箱(HSW-436)购自嘉兴市中新医疗仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 胚胎发育 6组人工气候箱，箱内温度分别设置为20℃、22℃、24℃、26℃、28℃和30 ℃, 各水温下，天然海胆受精卵，在盐度29～30、pH 8.1、光强30～100 lx的海水中培育，幼虫孵出24 h后开始投喂本实验室自繁的角毛藻，饵料密度为8 000～10 000 个/mL。每3 h由各气候箱随机取40个胚胎或幼虫在显微镜下观察，记录。

1.3.2 毒性试验 参照GB/T 18420.2-2009[18]中卤虫试验方法，用等比稀释法配制试验溶液，设定5个等比浓度组和1个空白对照组，等比系数不大于2.0，每个试验组设定4个重复。试验容器采用100 mL烧杯，试验液体积为40 mL，每个容器放入10个海胆幼虫。持续时间为96 h。试验环境因子：水温24～26 ℃，盐度28～30。每日投喂一次浓缩角毛藻，保持溶液中角毛藻密度约10 000～12 000个/mL。以死亡为观测指标，显微镜下观测沉于容器底部的海胆，15 s内腕足停止运动判定为死亡。

1.4 统计学分析方法

采用概率单位法计算致死中浓度(LC50); 实验数据用表示，采用SPSS19.0统计软件进行独立样本的t检验、F检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

变异系数的计算公式为：变异系数 C·V =(标准偏差SD/平均值Mean)×100%

2 结果

2.1 海胆胚胎发育观察

不同水温条件下紫海胆发育至相应阶段所需时间见表1，当水温为28 ℃或30 ℃时，168 h出现大量幼虫沉底死亡，其中30 ℃幼虫全部死亡; 当水温为20 ℃时，幼虫无法正常变态附着，直至观察到397 h, 所有幼虫死亡。试验结果表明,24～26 ℃时孵化成活率较高且孵化速度较快，在此条件下，受精卵孵化至二腕幼虫、四腕幼虫、六腕幼虫、八腕幼虫、出现管足所需时间分别为29 h、48 h、122 h、182 h和269 h。

2.2 毒性试验

表2～5分别为SDS、Cr6+、Zn2+、3,5-二氯苯酚对不同日龄海胆幼虫的毒性试验结果。经统计分析，每种参比毒物对4日龄、6日龄、8日龄、10日龄、12 日龄海胆幼虫的96 h LC50均无显著性差异(P＞0.05)。各参比毒物对不同日龄海胆幼虫LC50的变异系数为3.7%～100.9%，其中12 日龄海胆幼虫LC50的变异系数较低。

表 1 不同水温下紫海胆发育至相应阶段所需时间 h

2.3 参比毒物毒性大小比较

基于海胆浮游幼虫急性毒性试验，参比毒物对海胆幼虫的毒性顺序为: Cr6+＞Zn2+＞3,5-二氯苯酚＞SDS。

表 2 SDS对紫海胆幼虫的96 h急性毒性

表 3 Cr6+对紫海胆幼虫的96 h急性毒性

表 4 Zn2+对紫海胆幼虫的96 h急性毒性

表 5 3,5-二氯苯酚对紫海胆幼虫的96 h急性毒性

3 讨论

水温是海胆生长发育最主要的影响因子之一[19]，陈锤[20]研究表明，紫海胆适宜生长水温为15～30 ℃, 冯雪等[21]通过对紫海胆呼吸代谢的研究, 认为紫海胆生长最适温度为22～27 ℃，其正常生理耐受温度亦在22～27 ℃，当水温超过正常耐受温度时，正常生理活动受到破坏。不同水温下(15～31℃)紫海胆的活力与摄食实验[9]表明，紫海胆最适摄食水温为23～27℃。本研究表明，当水温为28 ℃和30 ℃时，浮游幼虫出现大量沉底死亡，水温低于20℃，幼虫无法变态附着，24～26 ℃时孵化成活率较高且孵化速度较快，是紫海胆生长发育的最适水温，与上述研究结果一致。

变异系数(CV)，又称“离散系数”，是概率分布离散程度的一个归一化量度，其定义为标准差与平均值之比，常用于比较多个样品重复测定的误差(不精密度水平)[22]。如重铬酸钾对稀有鮈鲫18次重复实验的96 h的LC50值在105.24～288.43 mg/L, CV＜35%; 3,4-二氯苯胺对稀有鮈鲫18次重复实验的96 h LC50值在4.42～8.75 mg/L，CV＜20%[14]。一般来说，CV越小，可重复性越强。本研究中，不同日龄海胆幼虫的96 h急性毒性试验结果CV差别较大，为确保毒性试验结果的可重复性和可靠性，一般应选择CV较小的实验条件。根据本研究，海胆急性毒性试验适宜的起始日龄为12 d。

本研究结果表明，紫海胆对水环境污染物敏感，如SDS对受精后12日龄紫海胆的96 h LC50为3.95 mg/L，而对4～6日龄黑褐新糠虾[23]和卤虫[24]的96 h LC50分别为11.6 mg/L和13.9 mg/L;Cr6+对12日龄紫海胆的96 h LC50为1.40mg/L, 而对体长为(3.0±1.0) cm稀有鮈鲫[14]和体长为(2.7±0.4) cm斑马鱼[25]96 h LC50分别为32.22 mg/L和23.60 mg/L; Zn2+对12日龄紫海胆的96 h LC50为1.69 mg/L，而对体质量为(0.48±0.13) g中华绒螯蟹仔蟹和体质量为(0.014 4±0.003 1) g克氏原螯虾幼虾的96 h LC50分别为5.84 mg/L和2.60 mg/L[26], 3,5-二氯苯酚对12日龄紫海胆96 h LC50为3.60 mg/L，而对沙蚕(Platynereis dumerilii)幼虫48 h LC50值为3.64 mg/L，此外，且紫海胆个体小、易于实验室饲养、繁殖周期短、分批产卵、生殖力强，是我国东南沿海生态系统中的重要物种，因此，紫海胆是一种较理想的海洋污染物毒性测试生物。