黄芪注射液对db/db小鼠肾脏IL-1β、MCP-1和TNF-α的mRNA表达的影响

朱丽坤, 曹 爽, 蒋仕林, 尹晓琳

(河北省中医院/河北医科大学免疫教研室, 石家庄 050017)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常见的微血管炎症的并发症，主要表现为毛细血管间肾小球硬化症，是1型糖尿病的主要死因，其机制复杂，以促炎因子为特征的慢性炎症已被公认为是其发生的机制之一[1]。近年来不少中药用于治疗DN有明显的疗效，黄芪的应用也取得了一定的研究进展。黄芪是豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的根，其性微温，可入肺经和脾经，具有补气健脾、升阳举陷、益卫固表、利尿消肿等功效[2]。已有研究发现，黄芪对细胞免疫、体液免疫和单核-巨噬细胞吞噬功能均有良好的促进作用，且临床上用于治疗DN有明显的疗效[3]。黄芪注射液是以黄芪为原料进行提取加工后的产物。db/db小鼠(diabetes mouse)由C57BL/KsJ近亲交配常染色体隐性遗传衍化而来，属Ⅱ型糖尿病模型，在4周龄开始贪食及发胖，继而产生高血糖、高血胰岛素、胰高血糖素等，发生严重的糖尿病症状，并有明显的肾病，一般在10个月内死亡。本次研究旨在通过检测db/db小鼠炎症细胞和炎症因子的表达，探讨黄芪注射液对于DN免疫细胞的调节作用，为完善黄芪注射液治疗DN的免疫作用机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4周龄SPF级C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2019-0009]，4周龄SPF级db/db小鼠购自北京大学医学部实验动物中心[SCXK(京)2016-0010]，饲养于河北医科大学实验动物中心[SYXK(冀)2018-003]。

1.2 主要仪器与试剂

全自动血细胞分析仪Sysmex 1800i, 购自日本Sysmex公司; 实时定量PCR仪, 购自美国AB公司; 流式细胞仪，购自美国BD公司；全自动酶标仪，购自美国Bio Tek公司; NanoDrop核酸浓度测量仪，购自美国Thermo Scientific公司；黄芪注射液(含黄芪生药1g/mL)，购自神威药业; 白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的ELISA试剂盒购自RayBiotec公司; IL-10、IL-1β、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和TNF-α的mRNA检测试剂盒购自生工公司；Real-time试剂盒购自日本TaKaRa公司；流式抗CD4、CD25、FoxP3标记抗体购自美国BD公司。

1.3 方法

1.3.1 动物处理及取材 C57BL/6鼠10只，雌雄各半，为对照组；db/db小鼠20只，雌雄各半，分为2组,每组10只，分别为糖尿病组和黄芪注射液治疗组。对照组、糖尿病组小鼠每只每日腹腔注射100 μL PBS，黄芪注射液治疗组小鼠按体质量每只每日腹腔注射100 μL黄芪注射液(浓度为1 g/mL)(因黄芪中的黄芪多糖经口给药难以被吸收进入血液，故在此选择腹腔注射的方式)，注射时间为12周。12周后摘除眼球取血，进行外周血白细胞计数及分类测定，提取血清测定细胞因子，取肾脏和脾脏组织分别进行Real -time PCR和流式细胞仪检测。

1.3.2 小鼠白细胞计数和分类检测 全自动血细胞分析仪测定小鼠白细胞计数及分类。

1.3.3 血清中IL-10和TNF-α的表达检测 按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.3.4 目的基因mRNA表达检测水平 提取小鼠肾脏组织的总RNA并对其浓度进行测定，RNA纯度A260/A280在1.8～2.1。将上述总RNA反转录得到cDNA，然后以cDNA为模板, 扩增β-actin(内参),IL-1β, TNF-α和MCP-1。循环参数：总体积为10 μL，预变性 95 ℃ 30 s; PCR反应: 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s；40个循环。数据处理使用相对定量值做统计学分析，柱形图用平均值做。

1.3.5 脾脏中调节T细胞(Tregs)检测 将脾脏研磨液置于离心管中, 离心弃上清，洗涤细胞后调节细胞浓度为1×106/mL，每管0.1 mL。试验管加CD4和CD25各2 μL，避光保存20 min。洗涤后，加入破膜剂，再加入抗FoxP3抗体2μL。孵育20 min后，洗涤，再加入4%多聚甲醛溶液0.1mL放置10 min，后加蒸馏水2 mL放置10 min。离心弃上清后，用PBS悬起细胞，于流式细胞仪检测Tregs。

1.3.6 统计学分析 实验均重复3次, 用SPSS16.0统计软件进行统计分析。所有数据均以s表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血白细胞数量、中性粒细胞和单核细胞百分比

发现糖尿病组小鼠白细胞计数、中性粒细胞百分比和单核细胞百分比与对照组比较明显上升，经过黄芪注射液治疗后的糖尿病小鼠的白细胞计数、中性粒细胞百分比和单核细胞百分比均明显下降(P＜0.05)(表1)。

2.2 黄芪注射液对血清中细胞因子变化的影响

糖尿病组小鼠的IL-10的含量与对照组比较明显降低(P＜0.05); 黄芪注射液治疗组小鼠IL-10的含量与糖尿病组比较有显著升高(P＜0.05)。糖尿病组小鼠TNF-α的含量显著高于对照组(P＜0.05);黄芪注射液治疗组TNF-α的含量与糖尿病组相比又明显降低(P＜0.05)(表2)。

表 1 不同组别小鼠白细胞计数、中性粒细胞百分比、单核细胞百分比的数值比较

表 2 不同组别小鼠血清IL-10和TNF-α的含量 pg/mL

2.3 小鼠肾脏炎症因子的mRNA表达

与对照组小鼠IL-1β mRNA的表达量(0.97±0.31)相比，糖尿病组 (10.43±2.41)有明显升高(P＜0.05)，而治疗组(0.49±0.36)与糖尿病组相比则显著降低(P＜0.05)。

与对照组小鼠MCP-1 mRNA的表达量(0.93±0.13)相比，糖尿病组(4.93±0.58)有明显增高趋势(P＜0.05)，而治疗组(0.46±0.14)与糖尿病组相比有显著降低趋势(P＜0.05)。

与对照组小鼠TNF-α mRNA表达量(0.97±0.03)相比，糖尿病组(4.63±0.87)有明显升高(P＜0.05)，而治疗组(1.35±0.57)与糖尿病组相比有明显降低(P＜0.05)。

2.4 黄芪对脾脏中Tregs细胞的影响

对照组小鼠的Tregs为2.42%±1.02%，糖尿病组的Tregs为3.53%±1.51%，黄芪注射液治疗组为4.99%±2.53%(图1)。黄芪注射液治疗组与糖尿病组和对照组比较均明显增加(P＜0.05)。

3 讨论

DN是糖尿病患者最严重的并发症之一。DN的发生和发展过程中有许多炎症因子的参与，例如，转化生长因子β、白细胞介素家族、趋化因子、黏附分子、Toll样受体、脂肪因子、血管内皮生长因子等激发一系列的炎症信号通路导致肾小管及肾间质纤维化、细胞外基质增厚，最终导致肾脏功能障碍[4]。目前，临床上应用黄芪治疗DN已有一定的疗效，但其作用机制尚不完全清楚。我们通过对免疫细胞及细胞因子的研究，探索DN的炎症反应及免疫作用机制。

有研究[5]表明，黄芪能够提高中性粒细胞、巨噬细胞的吞噬以及杀菌功能，能够促进细胞免疫以及体液免疫,但在糖尿病患者中黄芪能否减弱这些细胞的浸润，延缓DN发生还未见报道。本研究结果发现，经过黄芪注射液治疗的糖尿病小鼠白细胞总数、中性粒细胞百分比和单核细胞百分比较对照组均显著下降，证实了黄芪注射液有抑制炎症反应的作用。外周血白细胞的变化有望作为临床辅助检查，为DN患者的诊断与治疗效果的评估提供科学依据。

有研究[6]证实，糖尿病早期无肾病等并发症时, IL-10在炎性因素的刺激下水平升高, 而随着糖尿病并发症的出现, IL-10水平下降。本实验发现糖尿病组的IL-10水平低于正常对照组, 而黄芪注射液治疗组中黄芪注射液可以增加db/db鼠的Tregs数量, 并增加IL-10 的表达。这一现象说明黄芪注射液可能通过调节Tregs的数量和IL-10的表达抑制炎症反应，预防肾脏炎症的发生。

图 1 黄芪注射液对小鼠脾脏中Tregs细胞的影响

在DN发展过程中, 巨噬细胞等免疫细胞及肾小管上皮细胞等被激活后可以分泌TNF-α等促炎因子，使炎性反应细胞聚集与黏附，循环微血管扩张，通透性增强，参与了肾小球组织损伤[7]。本研究发现糖尿病组小鼠血清中TNF-α的水平升高，而黄芪注射液治疗组小鼠的TNF-α的血清蛋白表达水平与糖尿病组比较有所降低。说明黄芪注射液具有降低TNF-α的蛋白表达水平、减轻炎症反应、延缓DN的进展的作用。从炎症因子基因表达水平看，db/db小鼠经黄芪注射液治疗后,肾脏的IL-1β、MCP-1和TNF-α的表达水平与治疗前相比均有显著降低，这与之前的相关文献较一致，MCP-1可以促进巨噬细胞中单核细胞的转化，产生多种细胞因子如IL-6和TNF-α等，可诱导血管壁中的动脉粥样硬化，导致疾病进展，IL-1可修饰血管通透性和增加趋化因子的表达，从而导致肾小球膜细胞外基质的增殖和合成[8]。而治疗组小鼠这几个炎症因子的显著降低说明了黄芪注射液具有调节db/db小鼠肾脏的炎症作用。为临床应用黄芪注射液治疗DN提供可靠的实验依据，但其具体的作用机制有待进一步研究。