用微创的心导管技术制作兔心肌梗死模型

周志文, 汪毓诚, 赵莉芳, 曹佳齐, 丁跃有, 刘惠东, 侯 磊, 昌 薇

(上海市徐汇区中心医院/复旦大学附属中山医院徐汇医院,1. 心内科, 2.营养科, 上海200031;3. 上海交通大学医学院附属同仁医院心内科, 上海200050)

心肌梗死(myocardial infarction，MI) 动物模型制作是探索冠心病、心力衰竭等心血管疾病病理生理机制和治疗方法的重要环节。虽然猪、犬等大型动物MI模型有很多优点，但对操作技能要求高，且购买、饲养等成本高，难以常规开展大规模的实验，因而限制了其在科研中的应用，而体型较小的动物如鼠类等MI模型，与人体差异较大，研究成果不利于向临床转化[1,2]。

兔作为中小体型动物，大小适中，价格相对较低，容易饲养与操作，且与人的生理特征较相似，较多应用于心血管疾病的研究[2-4]。有关兔MI模型制作，国内绝大多数仍是使用开胸法制作，极少有像猪、犬等大型动物一样利用心脏导管微创技术制作MI模型[5]。

为此，本研究拟利用临床常用的心脏导管微创技术及器械制作兔MI模型，利用临床最常用的明胶海绵和弹簧圈作为小血管栓塞材料，旨在为研究MI等疾病的发病机制和治疗方法等提供更多可选择的科学实验模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

普通级新西兰白兔20只, 雌雄不限，5～6月龄，体质量2.0～2.5 kg， 由上海市松江区松联实验动物场提供[SCXK(沪)2017-0008]; 在上海交通大学医学院附属新华医院动物实验室进行实验[SYXK(沪)2013-0106]。本研究得到上海市徐汇区中心医院医学伦理委员会的批准(编号：201516)。小型DSA设备(ARCADIS Varic)购自德国Siemens公司，多导联心电图机(NIHON KOHDEN cardiofaxs ECG-1250) 购自上海光电医用电子仪器有限公司；装有ECG Viewer II软件的电脑。

1.2 冠状动脉操作前准备

用质量分数3%戊巴比妥溶液按1～1.5 mL/kg,用注射器多点肌肉内注射将兔全身麻醉后，从耳缘静脉建立静脉通道。按200 U/kg从静脉注入肝素。将4个别针分别刺入四肢，并与心电图肢体导联相连，以记录术中MI前后的心电图。心电图仪与装有ECG软件的个人电脑相连(动物的体表心电图可输入电脑，以备分析)[6]。将颗粒直径710～1 000 μm明胶海绵颗粒栓塞剂(杭州艾力康医药科技有限公司，中国)混入2～3 mL造影剂[碘克沙醇注射液，16 g(I)/50 mL，杨子江药业集团有限公司]中。

将颈部手术区的兔毛递净后，常规消毒铺巾。沿正中切开皮肤，分离出左或右侧颈动脉。利用临床用的桡动脉穿刺针，采用Seldinger 技术穿刺颈动脉，置入5F血管鞘并固定[6]。和临床冠状动脉造影一样，体外将三联三通分别连造影剂泛影葡胺、生理盐水、及压力监测系统。选用临床常用的5F右冠状动脉指引导管，并与三通管连接。

1.3 送微导管至冠状动脉

将指引导管的头端送入血管鞘。从指引导管内送入超滑导丝。在X线的透视下，在超滑导丝指引下，缓慢将指引导管的头端送至主动脉根部的窦底；其后撤出超滑导丝。

利用临床常用的0.014英寸-180 cm的微导丝头端塑型成一小弯，再送入大小为1.8F的Finecross微导管(Terumo公司, 日本)至其头端; 沿指引导管将微导管送至指引导管的头端。在排完空气后，经三通管向指引导管推注少许造影剂，显示指引导管的头端在主动脉窦底。缓慢调整指引导管，使其头端靠近主动脉根部的左侧。在注射造影剂的指引下，缓慢调整指引导管头端，使导管头端靠近左冠状动脉开口, 造影显示清晰的左冠状动脉及左前降支[7,8]。缓慢送微导丝至左前降支远端。其后固定指引导管和微导丝，沿微导丝缓慢推送微导管至左前降支近段或中段(视需求的MI程度而定)(图1); 本研究为提高兔存活率，故微导管头端均放置至左前降支的中段(第二对角支远端)。

撤出微导丝，从微导管缓慢注射少许造影剂，行选择性冠状动脉造影，显示出将要堵塞的目标血管(图2)。

1.4 实验分组及制作MI

将实验分成2组: 第一组从微导管注入明胶海绵颗粒栓塞剂混悬液1 mL，后利用微导管造影显示左前降支闭塞无血流，或血流明显减少(图3);第二组沿微导管送入直径0.018 英寸长为0.5 cm的弹簧圈(COOK Medical，丹麦)，在X线下可见弹簧圈送出微导管，至左前降支中段[8](图4);心电图显示2组较MI前ST明显缺血性改变(图5)，MI模型制作成功。拨出微导管、指引导管及血管鞘。结扎颈动脉，止血后缝合皮肤。手术结束后送动物回笼，继续饲养1个月。术后每日肌肉内注射青霉素40万单位，连续3d。

1.5 病理学观察

术后饲养1个月后，全身麻醉后处死动物，取出心脏，观察大体形态。标本置于体积分数10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，沿心脏长轴中点横切取材，切片4μm厚，用HE、Masson、天狼猩红染色，光学显微镜下观察病理组织学改变，以及梗死区与正常供血区心肌染色，并测量MI面积[5]。梗死区与正常供血区心肌染色用全景扫描仪扫描整体切片，截取整体图片保存用作分析。用IPP6.0软件进行分析，并用此软件读取蓝色颗粒所占面积，然后再读取整体心脏面积，最后计算面积百分比，即可获得MI面积。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 建模情况

利用25只兔实施本研究。早期由于操作缺乏经验，在送导管及注射造影剂时用力过大, 有3只兔在术中出现疑似主动脉撕裂及心包积液而死亡。后期改进, 导管在兔体内操作时缓慢细致, 死亡明显减少。3只兔因未能找到合适的左冠口, 或无法将微导管或微导丝送至左前降支, 未获成功。

图 1 指引导管、微导管及微导丝在左前降支

图 2 经微导管行左前降支造影

图 3 经微导管注入明绞海绵栓塞剂后再次造影

图 4 经微导管送弹簧圈至左前降支

图 5 冠状动脉闭塞前后心电图

共19只兔成功送入微导丝及微导管至左前降支。弹簧圈组10只, 其中1只在送入弹簧圈时微导管弹出，弹簧圈释放在主动脉窦底及左主干使兔死亡, 另2只在术中因室颤而死亡。因此，弹簧圈组兔获7只MI制作成功，但术后饲养中死亡2只。明胶海绵颗粒栓塞剂组兔9只，其中1只术中因室颤死亡，1只术后约1 h死亡，因此，MI制作成功7只，但随后饲养中死亡1只。2组实验操作成功率相似且均较高(表1)。

所有兔在MI制作中，在冠状动脉闭塞操作半小时内均有ST段抬高(图5)。术后兔恢复迅速，并正常饲养。

2.2 病理学检查

饲养中死亡3只兔，取出所有死亡兔心脏，肉眼均看到明显MI区。2组存活的兔在饲养1个月后全麻取出心脏行病理检查。三种染色均发现左心室有明显的MI区，2组兔MI面积差异均无统计学意义 (图6，表1)。

图 6 兔左心室MI病理学观察

表 1 两组实验操作中兔存活及术后病理检查情况对比

3 讨论

兔冠状动脉结构特性与人基本相似，是制作MI模型的常用动物[2-4]。有关兔MI模型制作，传统的开胸制作MI模型，常需要气管插管及人工通气供氧帮助[9]。开胸制作MI模型对动物创伤大，动物恢复慢，也容易造成心包粘连等，更不利于第二次开胸实验。更为重要的是，开胸制作MI模型可能因为创伤大，不但干扰了病理生理代谢, 也常因为心包粘连影响心肌重构等病理生理, 因此不利于MI及其后心衰等相关研究[7,10-12]。

Katsanos等[13]在无气管插管、人工通气供氧的情况下，利用导管技术制作MI实验动物模型，观察其心电图、心脏彩超的变化及心肌组织学特征，发现与开胸死亡无差别，证明了这种微创MI模型制作方法的可行性及有效性。而相比传统的开胸法，非开胸的导管法制作兔MI模型有如下优点：(1)较好地模拟人体内冠状动脉急性闭塞的情景，相比大多用开胸制作MI，非开胸法更贴近急性MI病理生理过程的特点；(2)操作简单方便，无须开胸，创伤小，也减轻对家兔的损伤，利于动物的恢复；(3)由于不会致胸腔粘连，为第二次实验手术提供极佳的MI模型，如干细胞注射等[7,8,13]。

本研究成功利用心脏导管临床常用技术制作稳定的兔MI模型，同时也发现，在左前降支内，无论是放置弹簧圈，还是注射明绞海绵栓塞剂，用两种方法制作兔MI模型成功率均较高，MI面积稳定, 且无明显差异。此外, 本研究仅为了制作MI，如需要制作心衰模型，则可将堵塞血管的部位升高，使MI面积更大，可明显提高心衰制作成功率，但动物死亡率也可能更高。

在实验操作方面，整体难度不大，大部分指引导管容易到达左冠状动脉开口，但有些需反复耐心调整指引导管，方能达左冠状动脉开口。同指引导管一样，大部分微导丝容易到达左前降支，但有部分也需要耐心，反复缓慢调整导管与微导丝方能成功。只有小部分可能因冠状动脉变异等原因，微导丝无法送至左冠状动脉。微导管送入冠状动脉后，操作应尽量迅速，否则因微导管堵塞冠状动脉血流时间过长，出现大面积心肌缺血，易出现室性心律失常甚至死亡。因此，在送入弹簧圈或栓塞剂后，应尽快将微导管撤出。另外，模型制作过程中应尽少用造影剂，以提高兔存活率。

总之，本研究探索的兔MI模型制作的微创技术和方法，操作简单，使用方便，实用性强，对将来涉及心肌缺血、心衰疾病研究均有很大的科研及社会价值。