2种有毒鹅膏菌形态学及rDNA-ITS测序鉴定*

田慧敏，王秀艳，田博宇，何 静，郭 蕊

（赤峰学院化学与生命科学学院，内蒙古 赤峰 024000）

鹅膏菌属（Amanita）是一类分布在全世界的大型真菌，属担子菌门 （Basidiomycotina） 伞菌目（Agaricales） 鹅膏菌科（Amanitaceae），种类多、分布广，全球范围内已描述且被承认的有500多种，我国有记录的约100种（含亚种、变种及变型）[1]。在鹅膏菌属中，有些种是美味的食用菌，但更多的是毒菌。如豹斑鹅膏（A.pantherina） 和毒蝇鹅膏（A.muscaria） 就是常见的毒菌，研究表明二者均含有鹅膏毒肽和毒蝇碱等有毒物质，误食后会产生嗜睡、激动交替出现幻觉、视听障碍等，有时还会出现肌肉痉挛[2-5]。豹斑鹅膏和毒蝇鹅膏菌盖颜色变化较大，误食后经常会出现中毒甚至死亡的情况，因此需要对其进行准确鉴定。然而传统鉴定方法往往受环境影响较大，有时会出现错误鉴定。许多菌物学家利用rDNA区域测序方法对该属真菌进行物种鉴别[6-9]，但单一的分子鉴定有时会出现假阳性、数据库限制等现象，从而造成误判。越来越多的菌物学家利用ITS测序和形态相结合的方法进行分类鉴定[10-12]。通过利用形态学和ITS片段测序相结合的方法，对2个内蒙古地区对鹅膏菌标本进行分类鉴定，为常见有毒鹅膏菌的准确识别提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试标本来源

供试标本CFSZ 10250、CFSZ 13024采集于赛罕乌拉自然保护区盔甲山，新鲜时拍摄生境照片，制作干标本、编号，超低温冷冻处理后存放于赤峰学院菌物标本室（Mycological Herbarium of the Chifeng College,Inner Mongolia,CFSZ）。

1.2 形态鉴定

观察新鲜子实体大小、形状、颜色、附属物、菌褶着生方式、菌柄等特征，其中颜色主要依据采集时拍摄的彩色照片判断。2个以上子实体作为重复，微观特征使用显微镜（江南JSZ6）来观察测量，包括担孢子、担子、褶侧囊体、褶缘囊体、菌盖菌丝和菌柄表皮菌丝等结构。孢子大小以30个以上不同孢子的长宽范围为重复，Q值为孢子长宽比范围及孢子长宽比的均值，将标本的菌褶、表皮等组织做成徒手切片，通常以4%～5%的KOH溶液作为浮载剂。然后根据文献 [1，2，6，13-14]进行鉴定和分类，用显微照相系统（Olympus BX53）拍摄显微结构照片。

1.3 ITS测序鉴定

1.3.1 基因组DNA的提取和PCR扩增及测序

取子实体干品的菌盖部分，研磨成粉末，称量30 g使用试剂盒提取基因组DNA，以引物ITS1/ITS4进行PCR扩增[15]，扩增产物经纯化后，委托上海生工生物科技有限公司完成测序。

1.3.2 ITS序列比较和系统发育分析

将已测序列在GenBank和UNITE数据库中进行Blast比对，从结果中挑选出同源性较高的ITS序列，然后使用软件MEGA5.1构建发育树，比较亲缘关系，鉴定到种。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定结果

经形态学鉴定结果CFSZ 13024为豹斑鹅膏 [A.pantherina(DC.)Krombh]，CFSZ 10250为毒蝇鹅膏[A.muscaria(L.)Lam.]

2.1.1 毒蝇鹅膏 [Amanita muscaria(L.)Lam.]

研究标本：2013年8月14日，内蒙古赤峰市巴林右旗，赛罕乌拉自然保护区，荣升景区，桦林地上散生子实体，编号CFSZ 10250，刘铁志、田慧敏等采集。标本CFSZ 10250宏观形态及微观结构见图1。

由图1可知，标本子实体中等大，菌盖直径7.5 cm，平展，边缘有短条纹，湿时稍粘，有少量块状鳞片，浅褐黄色，中央色深呈褐色，菌肉近柄处厚2 mm～4 mm，白色，无特殊气味。菌褶白色，后变淡黄色，密，不等长，褶缘平滑。菌柄长9 cm～13 cm，粗1.0 cm～1.3 cm，棒形，基部膨大，中生，白色，中空。菌环生于菌柄上部，双层，膜质，白色，宽1.1 cm左右，菌托白色，环带状。地下生。菌幕由囊状细胞和菌丝组成，囊状细胞大小为（24.0～50.0） μm× （14.4～19.2） μm。孢子大小 （8.4～12.0）μm×（6.0～8.4） μm （Q=1.26～1.40，Q=1.37±0.07），宽椭圆形至椭圆形，表面光滑，有小尖，无色，内含大油滴，无淀粉质反应。担子大小（36.0～57.6）μm×（8.6～10.1） μm，短棒状，中部膨大，子实层有锁状联合。菌盖表皮由菌丝组成，有的菌丝具黄色颗粒，直径7.2 μm～9.6 μm，有的菌丝无色透明，具锁状联合，直径8.4 μm～14.4 μm，有的顶端膨大，膨大细胞大小为 （40～70） μm×（15～20） μm。

毒蝇鹅膏（A.muscaria） 主要特点为表面颜色多样，鲜红色或桔红色、浅黄色等，以鲜红色或桔红色最典型，菌盖表面密被白色或稍带黄色的颗粒状鳞片，菌环宽，菌托环带状[1,13-14]。而标本CFSZ 10250菌盖橘黄色，中央色深呈褐色，鳞片极少，且易脱落，初步鉴定为毒蝇鹅膏少鳞变种（A.muscaria var.formosa），但根据最新文献[1]该种已并入[Amanita muscaria(L.)Lam.]。该标本虽然外形特征与典型的毒蝇鹅膏（A.muscaria） 有一些差异，但是显微特征及分子数据结果一致，因此将该标本鉴定为毒蝇鹅膏 [A.muscaria(L.)Lam.]。

2.1.2 豹斑鹅膏 [A.pantherina(DC.)Krombh]

研究标本：2016年9月6日，内蒙古赤峰市松山区，盔甲山自然保护区油松林地上，编号CFSZ 13024，田慧敏、牛梦枝采集。标本CFSZ 13024宏观形态及微观结构见图2。

由图2可知，标本子实体中等大，菌盖8.0 cm～13.0 cm，扁半球形至平展，黄棕色，青黄色，中央色深，具白色颗粒状鳞片，边缘有条棱，湿时表面粘。菌肉白色，无特殊气味，菌褶白色，离生，不等长，干后变为土黄色。菌柄长（8.0～17.0） cm×（0.8～2.5） cm，圆柱形，基部膨大呈臼状，有环带状菌托，菌环生菌柄中部。

孢子 （8.4～12.0） μm× （7.2～9.6） μm （Q=1.00～1.66），Q=1.27±0.19），椭圆形或近球形，有小尖，表面光滑，无色，含一大油滴。担子大小（33.6～48.0） μm×（8.4～12.0） μm，棒状，中部膨大，基部无锁状联合。菌盖表皮由辐射状排列的菌丝组成，菌丝无色，直径4.6 μm～9.6 μm，有的顶端膨大呈囊状，（60.0～84.0） μm×（13.2～16.8） μm。菌幕由囊状细胞和菌丝组成，囊状细胞无色，（27.6～40.8）μm×（9.6～24） μm，菌丝无色，隔膜少，直径2.4 μm～7.2 μm。菌柄菌丝无色，有锁状联合，菌丝直径 5.0 μm～7.2 μm。

该标本与球基鹅膏A.subglobosa和假球基鹅膏A.ibotengutake很相似，与A.subglobosa相比区别在于该标本担子基部有隔膜，无锁状联合，菌盖表皮往往无锁状联合，菌柄基部上的菌幕残余具更多菌丝，而后者担子大小为（44～65） μm×（10～13）μm，锁状联合很常见[12]，且分子数据显示，该标本与A.ibotengutake相似度不高，因此将该标本鉴定为豹斑鹅膏 [A.pantherina(DC.)Krombh]。

2.2 rDNA-ITS测序鉴定结果

2.2.1 PCR产物测序结果

供试样品子实体DNA序列PCR扩增产物测序结果为CFSZ 13024序列长度为704 bp，NCBI登录号为MG 367248；CFSZ 10250序列长度为637 bp，NCBI登录号为MG367251。

2.2.2 系统发育分析

以Volvariella volvacea作为外类群，对标本CFSZ 10250和标本CFSZ 13024的ITS序列及相似序列等26个ITS序列构建系统发育树，结果见图3。

如图3所示，结果聚为3类，分别为鹅膏亚属（Subg.Amanita） 的鹅膏组（Sect.Amanita）、鞘托鹅膏组 （Sect.Vaginatae） 和鳞鹅膏组 （Sect.Lepidella）。其中，标本CFSZ 10250和 [A.muscariaμ(L.)Lam]聚在一起，支持率97%；标本CFSZ 13024与A.pantherina和A.subglobosa聚在一起，其他都属于鹅膏组（Sect.Amanita）。由于A.pantherina和A.subglobosa亲缘关系很近，仅凭借ITS序列较难区分，因此结合形态学特征将CFSZ 13024鉴定为豹斑鹅膏A.pantherina。

综合上述，形态学鉴定方法和ITS测序法相结合，CFSZ 10250为毒蝇鹅膏 [A.muscaria(L.)Lam.]，CFSZ 13024为豹斑鹅膏 [A.pantherina(DC.)Krombh]。二者均属于鹅膏亚属（sub.Amanita） 鹅膏组 （Sect.Amanita）。

3 讨论

我国是食用菌分布和消费的大国，民间有采食野生食用菌类的习惯。豹斑鹅膏 [A.pantherina(DC.)Krombh]和毒蝇鹅膏 [A.muscaria(L.)Lam.]为2种十分常见的毒菌，大部分省市自治区均有分布，经常分布在阔叶林、针叶林及针阔混交林。毒蝇鹅膏A.muscaria存在严重地理分化现象，不同国家和地区毒蝇鹅膏的外形特征有较大差异[8]，菌盖颜色多样，有红色、橘红色、黄色、白色等，在我国主要为红色和橘红色。标本CFSZ 10250的菌盖为浅橘黄色，中间栗褐色，鳞片较少，与食用菌赤褐鹅膏（Amanita fulva） 的菌盖颜色相似，但赤褐鹅膏没有菌环，菌盖上没有菌幕，且具袋状菌托。

豹斑鹅膏（A.pantherina）盖面一般为褐色或棕褐色，有时污白色，散布白色至污白色的小斑块或颗粒状鳞片。标本CFSZ 13024的菌盖为青黄色或棕黄色，较难识别，豹斑鹅膏有剧毒，其与（A.muscaria）含有相似的有毒物质，卵磷脂（ibotenic acid）和毒蝇碱（muscimol），但所含浓度比其他毒蝇鹅膏多得多[2-4,16]，因此误食后死亡率很高。因此，在野生食用菌采食时应注意细致观察。

通过利用形态学和ITS测序相结合的方法，对2个常见毒鹅膏菌样本进行了鉴定，结果相互补充，准确、科学，为赤峰市有毒鹅膏菌种鉴定和种类划分提供参考。