氯喹抗病毒作用研究进展

钟景斌,刘文彬,王晖

(1.广东药科大学中药学院； 2.广东药科大学生命科学与生物制药学院/广东省生物活性药物研究重点实验室，广东 广州 510006)

磷酸氯喹是临床上最常用的抗疟药物，由于其免疫调节特性，在治疗系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病上已被广泛使用[1]。研究已显示氯喹具有广谱抗病毒活性[2]，在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》中首次将磷酸氯喹纳入抗病毒治疗药物[3]，因此，其对新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的治疗效果与开展临床试验情况备受关注。氯喹在疟疾治疗研究中有大量报道，但其治疗病毒性感染疾病研究较少，为此，本文主要从氯喹的抗病毒潜在作用机制、抗病毒研究状况、氯喹及衍生物在新型冠状病毒肺炎临床试验情况进行概述，强调需重视其在抗病毒治疗时的不良反应，为更好地了解其广谱抗病毒特点及临床上安全、合理应用氯喹及其衍生物治疗COVID-19提供参考。

1 氯喹抗病毒的潜在机制

氯喹可以通过干扰与细胞表面受体结合的病毒颗粒，阻碍受体与病毒的接触，抑制病毒早期的入侵。在抑制SARS-CoV研究中显示，氯喹可影响宿主细胞表面受体血管紧张素转换酶2(ACE2)，致糖基化缺陷而干扰病毒生长繁殖。另一方面，氯喹显弱碱性，通过升高体内的pH值干扰病毒以胞吞作用形成内吞体入侵细胞，破坏病毒进入细胞内复制所需的酸性水解酶，消除病毒膜与内体膜融合，防止病毒颗粒脱壳，阻断病毒的复制周期。由于病毒蛋白酶和糖基转移酶的翻译后修饰发生在内质网或反式高尔基体的囊泡内，氯喹可通过提高pH值干扰病毒蛋白质的翻译后修饰。抗HIV作用的研究显示，氯喹可通过某种方式促使病毒gp120片段变异，导致糖基化位点缺失而改变构象，干扰gp120糖基化，减弱了病毒对靶细胞的感染力。除此之外，氯喹对免疫系统的影响被认为是抗病毒作用机制之一，在淋巴细胞和巨噬细胞中的聚集使其具有抗炎特性，通过减少促炎细胞因子的分泌，降低受体介导的肿瘤坏死因子α(TNF-α)信号传导，调节免疫细胞，减少病毒感染时炎症因子产生而起到抗病毒作用[4-5]

2 氯喹的抗病毒作用

2.1 抗冠状病毒

冠状病毒是一种严重影响人类和动物健康的病原体，主要导致肠道或呼吸道疾病。2003年的严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、2012年的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、2019年的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)均为带有包膜的正链RNAβ属冠状病毒，可导致人类严重呼吸系统及全身症状疾病的发生[6]。氯喹的抗冠状病毒作用已有不少报道。

2.1.1 抗SARS-CoV

氯喹有效抑制SARS-CoV体外复制。Keyaerts等[7]证实氯喹对SARS-CoV感染非洲绿猴肾细胞(Vero E6细胞)有抗病毒作用，结果显示半抑制浓度IC50为(8.8±1.2) μmol/L，显著低于半数细胞毒性浓度CC50(261.3±14.5) μmol/L，进一步发现其在体外抑制SARS-CoV的IC50接近治疗急性疟疾时的血药浓度，提示其可以预防和治疗SARS-CoV感染，并提出氯喹可能调节SARS-CoV感染所致炎症反应的假设。Vincent等[5]在感染SARS-CoV的Vero E6细胞的前后阶段添加不同浓度氯喹，结果显示氯喹均能抑制病毒的复制与传播，具有显著的剂量依赖性，进一步研究发现可能与干扰细胞受体ACE2的末端糖基化有关。虽然，氯喹在体外抗SARS-CoV研究的数据为临床治疗提供可能性，但仍需在动物模型以及临床试验研究中验证疗效。

2.1.2 抗MERS-CoV

2012年6月，MERS-CoV在沙特阿拉伯首次发现[8]，研究人员试图从广谱冠状病毒抑制剂中寻找能够抑制MERS-CoV复制的药物。Wilde等[9]发现氯喹在半最大效应浓度EC50为(3.0±1.1) μmol/L浓度下抑制MERS-CoV感染人肝癌细胞(Huh7)的体外复制，且呈剂量依赖性。因MERS-CoV感染时与巨噬细胞(MDMs)和树突状细胞(MDDCs)间存在联系，Yu等[10]在MDMs和MDDCs中评估了氯喹抗MERS-CoV活性，结果显示其在这些原代细胞中没有活性，并强调了在原代细胞中评价药物的重要性。抗MERS-CoV的研究集中在体外实验，对于动物模型体内研究较少，有必要作进一步的研究。

2.1.3 抗SARS-CoV-2

武汉病毒所团队的Wang等[11]率先发表关于氯喹在体外试验中有效阻断SARS-CoV-2感染Vero E6细胞中病毒复制的研究。数据表明氯喹在EC50为1.13 μmol/L时即可有效抑制SARS-CoV-2感染，且抗病毒EC90值与用于治疗类风湿关节炎的血浆浓度接近，提示有可能对新冠肺炎起效。临床试验初步显示，使用磷酸氯喹治疗COVID-19患者8 d内咽拭子核酸阴转率高达80%(8例/10例)，显著优于使用洛匹那韦/利托那(20%，3例/15例)[12]。相对于陈军等[13]利用硫酸羟氯喹治疗30例普通型COVID-19患者初步研究表明，标准剂量的硫酸羟氯喹(400 mg，1次/d)治疗并未显示出有改善患者症状、加速病毒抑制等方面的临床效果，但注意到以病毒转阴率、重症化率为主要终点的研究难以对药物的疗效进行比较，还需充分考虑样本量等可行性问题。另据Gao[14]报道已有100多名新冠肺炎患者的临床试验结果表明，磷酸氯喹在抑制肺部炎症的恶化、改善肺部影像学表现、缩短病程等方面好于对照治疗，且上述患者服药之后尚无严重不良反应的发生。上述研究进一步明确了氯喹对COVID-19临床治疗的有效性。

2.2 抗HIV

氯喹对抗HIV的研究集中在体外实验及患者体内。Savarino等[15]报道氯喹通过影响病毒包膜糖蛋白的产生抑制HIV-1和HIV-2的复制，影响gp120的末端糖基化以及干扰2G12抗体表位形成使氯喹具有广谱抗HIV活性。一项临床试验表明[16]，慢性HIV感染者在治疗期间服用氯喹，CD8T细胞以及CD8和CD4 T细胞中Ki-67的表达显著降低，显示其可降低全身性T细胞免疫活性，抑制HIV感染所引起的持续性免疫活化，揭示氯喹干预相关的HIV疾病发病机理。由于慢性免疫激活与HIV-1发病机制存在相关性，Martinson等[17]发现氯喹抑制HIV-1通过Toll样受体7(TLR 7)诱导浆细胞样树突状细胞(pDC)分泌干扰素α(IFN-α)，降低IFN-α介导的免疫激活并改善T细胞存活，显示氯喹通过免疫调节作用干扰艾滋病毒在免疫激活方面的发病机制。除此之外，对氯喹联合4种抗HIV药物在体外考察抗HIV-1活性研究[18]，显示联用可以协同、相加或拮抗的方式抑制HIV-1活性，为联合抗HIV药物治疗艾滋病提供了参考。

2.3 抗ZIKV

寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)是通过蚊子和蜱传播给人类，属于黄病毒科黄病毒属的RNA病毒，每年造成数百万次感染[19]。ZIKV感染后主要损害人类神经前体，导致感染后孕妇中胎儿出现小头畸形的可能性增大，但对其发病机制尚不明确。Li等[20]在体外筛选出氯喹显著抑制ZIKV感染，并在小鼠模型中发现氯喹保护胚胎中小鼠免受ZIKV感染及降低相关的小头畸形出现。进一步研究显示可降低细胞凋亡指示物半胱天冬酶3的激活，进而减少胎儿大脑中细胞凋亡效应。Shiryaev等[21]研究表明氯喹可能以升高内体的pH值机制阻碍ZIKV通过内吞作用和酸性内体中的膜融合感染细胞，进而抑制ZIKV感染和人类神经球细胞凋亡，降低急性ZIKV诱发的干扰素信号缺陷AG129小鼠的死亡率，抑制SJL小鼠ZIKV的感染，减少母婴垂直传播，表明氯喹可用于ZIKV的治疗和预防。

2.4 抗DENV

登革热病毒(Dengue virus，DENV)由埃及伊蚊和白纹伊蚊等媒介传播的急性传染病。体外实验中显示氯喹在Vero细胞培养物中干扰2型登革热病毒的复制，表明其可能通过引起体内pH的升高，破坏了病毒包膜和内体膜融合，抑制了病毒的复制过程[22]。一项129名患者进行了氯喹抗登革热的随机、双盲实验[23]，结果发现其可降低患者疼痛症状以及改善日常活动能力(P<0.05)，但没有缩短疾病的持续时间或减弱发热的强度。一项食蟹猴感染2型登革热病毒研究[24]显示与对照组相比，氯喹治疗后动物病毒血症的时间明显减少，其中血清中肿瘤坏死因子α和干扰素γ的浓度显著降低，表明其可能通过抗炎作用干扰动物体内登革热病毒2型的复制。这些为氯喹防治登革热疾病提供了潜在的治疗方案。

2.5 抗CHIKV

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)是通过节肢动物传播的病毒，该病典型的特征是在急性感染期内，通常以发热、肌肉疼痛和关节痛为特征。Khan等[25]研究了氯喹对Vero细胞中CHIKV复制情况，发现抑制病毒机制可能是防止内吞作用或内体酸化抑制CHIKV早期的复制，并以剂量依赖的方式减少了CHIKV感染。Chopra等[26]报道以70名CHIKV感染患者为研究对象，观察氯喹对急性CHIKV感染后治疗早期肌肉疼痛、骨骼疼痛和关节炎的优势，结果显示氯喹与美洛昔康对患者症状有改善，但与对照组无疗效差异，而氯喹治疗组显示炎症细胞因子白介素6(IL-6)、白介素13(IL-13)水平明显升高，需要进一步明确机制。以食蟹猴为研究对象，显示氯喹使患急性基孔肯雅病的食蟹猴血液中病毒清除速度减慢，病毒载量升高，加重CHIKV感染[27]；另一项对54名CHIKV感染患者临床研究显示氯喹没有改善患者临床症状，随时间推移,大部分患者经历关节疼痛，显示氯喹对治疗CHIKV患者无明显疗效，反而提示用药时间过长会增加不良反应的风险。

2.6 抗人禽流感病毒

Yan等[28]报道氯喹抑制甲型H5N1禽流感病毒感染人肺癌A549细胞的死亡，并以剂量依赖的方式提高细胞的生存力。在甲型H5N1禽流感病毒诱导小鼠模型中观察到，治疗组的浸润性白细胞较少，肺水肿显著降低，表明氯喹作为自噬抑制剂可有效地改善急性肺损伤，提高存活率。在此之前，有研究显示[29]H5N1通过一条涉及激酶Akt、肿瘤抑制蛋白TSC2和哺乳动物雷帕霉素靶点的通路诱导肺泡上皮细胞自噬细胞死亡，提示氯喹作为自噬阻滞剂可能对人类感染H5N1病毒有一定的预防和治疗作用。

2.7 抗其他病毒

Vigerust等[30]在体外验证了氯喹对流感病毒有抑制活性，但在动物模型中没有显示出预防或改善流感症状的有效性。有研究显示[31]氯喹在体外抑制埃博拉病毒(EBOV)复制，而在豚鼠模型中未能显示有效预防EBOV的感染。猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus，FIPV)由猫冠状病毒(feline coronavirus，FCoV)引起的致命疾病，Takano[32]研究证明氯喹在体外具有抑制FIPV复制和抗炎作用，在诱导患FIPV猫的模型研究显示氯喹治疗效果优于对照组，表明氯喹对猫传染性腹膜炎(FIP)有治疗作用。手足口病是最常见的肠道病毒(Enterovirus)相关疾病之一，好发于幼儿和免疫功能低下的成人，Tan[33]研究氯喹对几种血清型肠道病毒(肠道病毒A型和B型)具有抗病毒活性，在动物模型中显示其提高感染肠道病毒71型(enterosvirus71,EV71)小鼠的存活率。勐腊病毒(Mengla virus,MLAV)是具有蝙蝠-人跨种传播危害的丝状病毒。陈勍等[34]建立囊膜表面糖蛋白(glycoprotein,GP)介导MLAV进入细胞模型，证实氯喹可有效阻断MLAV进入宿主细胞的能力，降低埃博拉病毒(EBOV)感染小鼠死亡率。这些研究显示氯喹的广谱抗病毒性，但具体作用机制仍需深入研究发现。

3 氯喹及其衍生物在COVID-19临床试验研究情况

在中国临床试验注册中心的新型冠状病毒肺炎临床研究索引中筛选出关于氯喹及其衍生物的临床试验情况，包含了磷酸氯喹、羟氯喹(硫酸羟氯喹与磷酸氯喹对比治疗研究)。按照研究设计分为非随机对照、随机平行对照、单臂设计、双盲随机平行对照、单盲随机对照。临床试验收治患者分为轻症和普通型、轻中度、重症及危重症COVID-19患者。在给药途径方面，多数以口服方式，极少数以雾化吸入溶液进行探索性临床试验研究。但从目前的情况来看，磷酸氯喹开展COVID-19临床研究比较多，且临床数据初步显示磷酸氯喹的疗效与安全性。相反，羟氯喹的疗效评价则需要更多临床数据进一步验证治疗效果以及需密切关注其用药后不良反应的发生。

4 不良反应

氯喹由于治疗疾病范围的不断扩大，其不良反应报道随之增多。主要的不良反应有：(1)消化系统。比较常见，以食欲减退、恶心、呕吐、腹痛、腹泻为主。(2)神经肌肉方面。表现多为肌无力、麻木、肌肉萎缩。(3)广泛的神经精神症状。如头晕、头痛、失眠、谵妄、焦虑、抑郁、情绪障碍等反应。(4)变态反应。主要集中在皮肤上，如皮疹、光敏性皮炎、色素沉着、银屑病加重、瘙痒等。(5)心脏毒性。可抑制窦房结，延长QT间期、导致心律失常、心力衰竭、低血压等症状。因此，用药前需要了解患者是否患有心脏基础性疾病等病史，用药前需做好心电图检查。(6)长期使用会引起眼部毒性反应。由于氯喹在角膜上被吸收，导致角膜沉积与视网膜病变，严重影响视力，多与用药剂量有关。使用时应进行眼科检查。(7)血液系统影响。罕见再生障碍性贫血、各类血细胞减少症、粒细胞缺乏症和溶血性贫血等。

氯喹作为在临床上应用多年的老药，其安全性与疗效已得到了良好的验证。然而，对COVID-19的治疗需要根据患者实际情况如患者过敏史、过往用药情况、病情发展阶段来制定安全的用药方案，对于存在慢性疾病尤其在服药时间较长的情况下应做好不良反应监测，注意患者的眼科视力、心脏等异常症状，若发生严重不良反应时应及时停药处理，以免加重病情恶化。大多数的不良反应在停药后症状可减轻、改善。刘华静等[35]最近报道3例COVID-19患者口服氯喹500 mg，2次/d后均出现心悸、心电图异常现象，在停用氯喹后，不良反应症状消失。值得关注的是，国家卫生健康委[36]下发了《关于调整试用磷酸氯喹治疗新冠肺炎用法用量的通知》的文件，明确了磷酸氯喹在新型冠状病毒肺炎治疗中的适用人群和具体的用法用量，对禁忌症和相对禁忌症及注意事项作了详细的指导，确保该药在临床使用中更加安全有效合理。

5 小结

大量体外研究表明氯喹具有广谱抗病毒活性，但因为在整体动物模型的药效学研究中不够深入，缺乏相应的基础性研究，对于氯喹的抗病毒作用机制尚未得到科学的、统一的认识，这对于重新开发氯喹抗病毒的治疗作用有一定阻碍。同时，人类对病毒的认知、研究在不断深入，但对于新发现的病毒如何入侵人体、导致发病的机制等方面仍需进行大量的科学研究。在临床上，补充新的临床数据对重新评价氯喹新的治疗作用有积极促进作用。目前，国内已有20多项关于氯喹及其衍生物对新型冠状病毒肺炎的临床试验研究，这将有助于全面、科学的评价氯喹对新型冠状肺炎的临床疗效。因此我们也需要重新评估氯喹及其衍生物在新型冠状肺炎的用药剂量和安全性，注意联用其他药物治疗的相互作用，加强对不良反应的监测，为患者提供临床有效、安全用药方案，这些需要在临床试验中进一步明确。