基于网络药理学联合GEO芯片探析培土清心方治疗特应性皮炎的分子机制

吴汶丰，张泽鑫，梁一飞， 王家爵，杨贤平，裴悦，李红毅

(1.广州中医院大学第二临床医学院，广东 广州 510405； 2.广东省中医院，广东 广州 510105)

特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病，临床以瘙痒和反复发作的湿疹样皮损为特征。目前，AD治疗仍以局部应用润肤剂和糖皮质激素为基础，辅以钙调磷酸酶抑制剂、抗微生物制剂等[1]。长期使用糖皮质激素会带来皮肤及全身各系统的副作用。中医药基于整体观念和辨证论治原则，具有疗效显著、副作用小、远期疗效佳等优点。培土清心方治疗特应性皮炎临床疗效确切，该方治疗AD 3个月后SCOARD评分有显著意义的下降[2]。

广东省中医院陈达灿教授，拥有丰富的临床经验，提出AD的主要病机为“脾失健运，心火亢盛”，婴幼儿先天禀赋不足，脾胃虚弱为本，脾虚湿生，郁而化热，子病及母，心火亢盛为标，本虚标实，湿热郁结肌肤，发为本病。“培土清心方”作为陈达灿教授治疗AD的验方，方含太子参、灯芯草、淡竹叶、甘草、连翘、白术、山药、薏苡仁、钩藤、牡蛎。连翘与太子参共为君药，连翘清热解毒，消痈散结，长于清心泻火。太子参补气生津，为补气药中清补之品，共奏培土清心之效；辅以臣药山药、白术、薏苡仁健脾除湿、平补脾胃；灯芯草和淡竹叶，利尿除烦清心火。佐药为牡蛎、钩藤，功能潜阳益阴、清心降火，甘草培土且调和诸药。诸药合用，可达培土清心、安神止痒之功[3]。目前认为培土清心方主要通过干预IL-4，IL-10，INF-γ等因子及淋巴细胞调节免疫失衡状态发挥作用[4]，但进一步的信号通路、基因等作用机制目前尚不明确。

GEO数据库(Gene Expression Omnibus,GEO),收录了生物学领域大量的高通量实验数据，且提供多种疾病的基因表达谱信息。通过生物信息学分析，能够有效挖掘其潜在价值，筛选出与疾病发展密切联系的差异基因[5]。网络药理学是结合文本挖掘和数据库分析的新兴药物研究方法，可全面展示药物、靶点与疾病之间的关系。中药复方由于其多成分、多靶点、多途径的作用特点，作用机制的探索一直是其研究热点和难点，但网络药理学的全面分析可以展示其可能的作用靶点和通路，为进一步针对性的研究提供依据和思路。因此，利用网络药理学对培土清心方进行全面分析，是明确其作用机制的必经之路。

1 材料与方法

1.1 特应性皮炎GEO芯片获取与热图、火山图的绘制

利用GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)，搜索“atopic dermatitis”，物种限制为人，下载基因矩阵与平台数据文件，运用“geoPharm04. ann.pl”脚本，将下载的探针转化对应的基因名称。运用R软件引用“limma”包，获取上调和下调的差异基因，保存到于excel中。引用”pheatmap”包，获取上调或下调最显著的前20个基因，绘制热图与火山图。

1.2 培土清心方活性成分筛选

利用TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，限定物种为人，分别检索连翘、太子参、灯芯草、山药、薏苡仁、茯苓、钩藤、甘草。生物利用度(Oral bioavailability,OB)指药物被人体吸收速度与程度，口服生物利用度(OB)≥30%，表明药物有较好的口服生物利用度。类药性(drug-likeness,DL)是化合物与已知药物之间的相似性。类药性(DL)≥0.18，表明化合物有较好化学稳定性及溶解度。利用BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)，分别以淡竹叶，牡蛎为检索词，设置“score cutoff≥20”，”校正后P值<0.05”，获取具有统计学意义的有效活性成分和基因。

1.3 培土清心方有效成分及基因注释

利用Drugbank数据库(https://www.drugbank.ca/)，分别获取培土清心方活性成分对应的基因，保存为“targetName.txt”。运用Perl脚本和Uniprot数据库，获取”targetName.txt”中培土清心方基因全称所对应的基因缩写，命名为“targetsymbol”。

1.4 培土清心方-特应性皮炎-分子基因网络图构建

将“1.2”中培土清心方药物活性成分和“1.3”获得的基因，与“1.1”中特应性皮炎差异基因相互映射，将数据保存为“txt”格式，导入cytoscape3.7.2软件，绘制培土清心方-特应性皮炎的分子基因网络，获取重要的活性分子与疾病基因。

1.5 培土清心方治疗特应性皮炎拓扑网络构建

利用“1.4”中映射后的疾病差异基因，导入cytoscape3.7.2，运用Bisogenet及CytoNCA，设置度中心性(DC)>61，中介中心性(BC)>600。一个节点DC值越大，该节点在网络中就越重要。BC指一个节点担任其他2个节点之间最短路的桥梁的次数，BC值越大，说明该节点愈重要。

1.6 培土清心方治疗特应性皮炎的GO功能与KEGG通路富集分析

通过R软件，从GO、KEGG数据库中获取培土清心方-特应性皮炎每个基因所对应的功能，设置筛选条件为pvalueCutoff<0.05和qvalueCutoff<0.05，并计算每个功能上的基因富集数，最后将排名前20的GO生物过程和KEGG通路，绘制成柱状图。

2 结果

2.1 特应性皮炎GEO芯片获取与热图、火山图的绘制

从GEO数据库下载GSE63741芯片与平台数据，共50个样本。图1热图中标签中蓝色C代表正常组，粉色T代表实验组。基因上调程度越高，颜色越红。基因下调程度越低，颜色越绿，黑色代表中间表达的基因。图2火山图中，每个点代表基因，黑色是表达在正常组与实验组中没有差异的基因，绿色点代表在正常组下调的基因，红色点代表在实验组上调的基因。

图1 正常组与特应性皮炎患者差异基因热图Figure 1 Heat map of differential genes between normal control group and atopic dermatitis patients

图2 正常组与特应性皮炎患者差异基因火山图Figure 2 Volcano map of differential genes between normal control group and atopic dermatitis patients

2.2 培土清心方-特应性皮炎-分子基因网络图构建

与特应性皮炎相关的中药活性成分共143个，其中灯芯草活性成分7个，茯苓8个，甘草72个，钩藤27个，连翘9个，山药7个，太子参4个，薏苡仁4个，淡竹叶3个，牡蛎2个。

培土清心方-特应性皮炎-分子基因网络图中(见图3)，大多数药物分子作用于多个疾病基因。对应疾病基因最多的前3个分子分别是MOL000098、MOL000006、MOL000449,其代表的活性分别为槲皮素、豆甾醇和木犀草素。特应性皮炎的基因中，PPARG对应多个药物分子。

图3 培土清心方-特应性皮炎-分子基因网络Figure 3 PTQX formula-atopic dermatitis-molecular gene network

2.3 培土清心方治疗特应性皮炎基因的拓扑网络图

设置BC>600，共得到12个核心基因，如图4C，并按BC值大小进行排序，BC数值越大，表明基因在该网络中越重要。BC值排名前二的基因为TP53和NTRK1，是培土清心方治疗特应性皮炎的重要候选靶标。

图4 培土清心方治疗特应性皮炎基因的拓扑网络图Figure 4 Topological network of PTQX formula for the treatment of atopic dermatitis

2.4 培土清心方治疗特应性皮炎的GO功能与KEGG通路富集分析

图5 ，BP(biological process),纵坐标代表培土清心方-特应性皮炎基因的生物过程，图6，CC(cell component),纵坐标代表培土清心方-特应性皮炎基因的细胞成分。图7，MF(molecular function)，纵坐标代表培土清心方-特应性皮炎基因的分子功能。图8，KEGG通路图中，纵坐标代表培土清心方-特应性皮炎基因的通路，横坐标代表富集在该通路的基因个数。彩色代表P值，P值越小，颜色越红。

图5 培土清心方治疗特应性皮炎基因生物过程(BP)图Figure 5 Biological process (BP) of PTQX formula in the treatment of atopic dermatitis

图6 培土清心方治疗特应性皮炎基因细胞成分(CC)图Figure 6 Cellular component (CC) of PTQX formula in the treatment of atopic dermatitis

图7 培土清心方治疗特应性皮炎基因分子功能(MF)图Figure 7 Molecular function (MF) of PTQX formula in the treatment of atopic dermatitis

图8 培土清心方治疗特应性皮炎的KEGG通路富集分析Figure 8 Enrichment analysis of KEGG pathway of PTQX formula in the treatment of atopic dermatitis

3 讨论

本研究基于网络药理学联合GEO数据库，分析培土清心方治疗特应性皮炎的分子作用机制，培土清心方-特应性皮炎基因网络图，可以看出槲皮素、豆甾醇和木犀草素对应多个疾病基因，因此它们很可能是培土清心方的多效活性化合物，培土清心方君药为连翘和太子参，其中槲皮素是连翘有效活性成分，豆甾醇为太子参有效活性成分。槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗过敏、抗衰老、抗癌等药理作用，能够调节白细胞介素(IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)x、组胺、肥大细胞中类胰蛋白酶的释放[6]，从而对AD具有治疗作用。 豆甾醇是一种具有确定的免疫调节特性的天然甾醇，Antwi AO[7]等研究发现，豆甾醇具有控制炎症的特性，使小鼠耳部皮肤水肿和中性粒细胞减少，并且还可降低局部应用TPA诱导的TNFα的血清水平。豆甾醇可显著降低小鼠耳朵皮肤组织的表皮层增厚和炎性细胞浸润。薏苡仁作为培土清心方臣药，其含有有效成分木犀草素。木犀草素是一种天然黄酮类化合物，具有抗炎、抑菌、免疫调节的作用。王倩等[8]发现木犀草素主要是通过抑制DNA拓扑异构酶的活性，进而影响菌体核酸及蛋白质的合成，从而抑制金黄色葡萄球菌活性。而金黄色葡萄球菌通常定植在AD患者皮肤上，导致疾病发展和恶化[9]。故木犀草素可能通过抑制金黄色葡萄球菌，对AD产生治疗作用。

特应性皮炎的基因中，PPARG对应多个药物分子，是培土清心方发挥治疗作用的重要靶标。PPARG也被称为PPARγ，为过氧化物酶体增殖物激活的受体γ。近年来，过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-γ的抗炎作用已得到广泛研究。PPAR-γ激动剂作为单核细胞和巨噬细胞的负调节因子，并且剂量依赖性地抑制人单核细胞中炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的产生[10-11]。培土清心方可能通过PPARG受体，发挥对AD的抗炎作用。

GO富集分析主要涉及response to steroid hormone生物过程、nuclear receptor activity分子功能、condensed chromosome细胞过程。response to steroid hormones是对类固醇激素反应的生物过程，糖皮质激素因其特殊的抗炎、抗增生、免疫抑制和血管收缩作用，而被用于治疗AD的一线药物[12]。雌激素与胶原蛋白合成、皮肤厚度和皮肤含水量增加(通过透明质酸的产生)以及屏障功能和伤口愈合的改善有关[13]。这与AD发病密切相关，皮肤屏障破坏会使经皮水分丢失量(TEWL)增加，摄取过敏原增多，从而促发过敏反应和加重 AD 的炎症反应[14]。nuclear receptor activity代表核受体活性，核受体是转录调节因子，培土清心方富集在该分子功能上基因有PGR、AR、PPARG、SREBF1。PGR为孕激素受体，在排卵期，雌激素和孕酮的水平升高会抑制迟发型超敏反应，而这两种激素的水平较低都与斑贴试验反应性增强有关，从而导致AD患者的病情加重[15]。雌激素、孕酮可能会抑制细胞免疫[16]。故培土清心方可能通过调节对类固醇激素反应，核受体活性，参与对细胞免疫的调控。

KEGG分析显示，培土清心方可能通过影响AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications(糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路)来实现对AD的调控。富集于该通路基因为BAX、CCL2、SELE、F3、PRKCB、SERPINE1。CCL2也被称作MCP-1，该趋化因子是CC亚家族的成员，是涉及免疫调节和炎症过程的分泌蛋白超家族。MCP-1表达水平在个体之间高度可变，可能会导致对各种炎症状况的差异敏感性[17]。刘文静[2]亦研究培土清心法对CC亚家族趋化因子的影响，实验结果表明该中药可能通过降低CC亚家族血清中的MDC、CTACK水平而起治疗作用。

综上，培土清心方治疗特应性皮炎是通过多成分、多基因、多通路发挥抗炎、调节细胞免疫、抑菌的作用，这将为进一步深入研究此方作用机制提供参考。也为培土清心方治疗AD的基础、临床研究及新药研制提供一定的理论依据。