基于网络药理学探讨定喘汤治疗哮喘的作用机制

吴振起，任园园，王楠，王雪飞

(1.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁中医药大学研究生学院，辽宁 沈阳 110847)

有关哮喘，最早将其作为独立病名的是朱丹溪的《丹溪心法·喘论》，其言“哮喘其证有二，不离痰火……”后沿用至今，哮喘病因复杂，中医认为其为多种致病因素共同作用而致，可概括为痰饮内伏、邪气侵袭、饮食不节、情志内伤及体质因素[1]。从西医角度来看，哮喘是涉及多种细胞及细胞因子并伴随有支气管收缩、气道高反应性、气道重塑的一种慢性炎症性疾病，主要与气道高反应性、气道炎症、遗传基因及过敏等因素有关[2]。

定喘汤源于《摄生众妙方》，由白果、麻黄、苏子、甘草、款冬花、杏仁、桑白皮、黄芩、法半夏9味中药组成，是治疗风寒外束、痰热内蕴之哮喘的代表方。方中麻黄宣降肺气以定喘、兼解表寒，白果敛肺止咳、化痰平喘，两药一收一散，既可增强平喘之功，又可防止麻黄过耗肺气，共为君药；杏仁、半夏、苏子、款冬花降气化痰，增强平喘之功，共为臣药；桑白皮、黄芩共奏清泻肺热、止咳平喘之效，共为佐药；甘草调和诸药为使。本方诸药合用，使得肺气宣降，痰热得清，风寒得解，从而达到治疗目的。

网络药理学概念于2007年由药理学家Hopkins A L教授首次提出[3]。网络药理学基于药物、基因、靶点以及疾病相互作用网络的基础上，经网络分析，系统了解药物对疾病的影响，进而揭示出多成分药物作用于人体的奥秘，这与中医治病的整体观念原则以及中药复方多成分、多途径、多靶点相互作用特点相吻合，为中药复方作用机制的研究提供了新的技术手段，有利于揭示中药复方本质、发现药物作用靶标、指导中药新的研发，进而为传承和发展中医药现代化发展提供新的支撑[4]。本研究将网络药理学的研究思路与中药定喘汤相结合，进而探讨其治疗哮喘的活性成分以及可能的分子作用机制，旨在为后续的实验研究提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 建立定喘汤化学成分数据库

通过Traditional Chinese Medicine Systems Pharma-cology Database and Analysis Platform 网站(TCMSP)查询得到定喘汤中药物(白果、麻黄、苏子、甘草、款冬花、杏仁、桑白皮、黄芩、半夏)的化学成分。

1.2 药物有效成分筛选

将口服生物利用度(OB)≥30%，药物相似性(DL)≥0.18作为筛选药物有效成分的标准[5]，并利用Cytoscape3.7.2软件构建中药-化学成分网络图。

1.3 查找药物作用靶标

在TCMSP网站中找出药物有效成分所对应的靶标。

1.4 建立疾病靶标数据库

在GeneCards数据库中检索关键词“asthma”得到与哮喘相关靶点并通过相关性得分(relevance csore)进行筛选，选取score≥1.5的数据构建哮喘相关靶点数据库[6]。

1.5 作用靶点与哮喘靶点的Venn分析

将定喘汤主要化学成分的作用靶点与哮喘靶点数据库进行Venn分析，得到两者共同基因，从而初步得到定喘汤治疗哮喘的作用靶点。进而将交集靶点数据导入DAVID数据库，限定其研究物种为人，将所有靶基因名称校正为官方名称。

1.6 蛋白质相互作用关系(PPI)网络图构建

将上述得到的交集靶点导入STRING数据库，蛋白种类设置为“Homo sapiens”(智人)，其余参数均保持默认，构建PPI网络图，寻找靶点间相互作用关系；进一步根据网络拓扑学理论筛选出关键靶点，其在网络中作用尤为显著。将所得数据结果保存为TSV格式，并导入Cytoscape3.7.2软件，进一步利用其“Network Analysis”功能进行网络拓扑属性分析。根据节点度值分布(Node Degree Distribution)和介数中心(Betweenness Centrality)2个重要网络拓扑参数进行筛选，选取两者同时在平均值之上的靶点作为定喘汤的关键靶点。根据Degree值绘制出关键靶点节点的条形图。

1.7 “中药-化学成分-关键靶点”图绘制

通过 Cytoscape3.7.2 软件将中药、化学成分及关键靶点相连，绘制出“中药-化学成分-关键靶点”相互作用网络图。

1.8 进行GO与KEGG通路富集分析

通过采用R-3.6.1及perl脚本对 PPI 网络中的蛋白质进行基因本体论(GO)生物学功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。从而分析关键靶点参与的生物过程及研究出相关靶点可能作用的重要通路及药理学意义。

2 结果

2.1 定喘汤有效成分

通过在TCMSP数据库中检索，获得本方药物成分共1 565个，将1 565个成分根据OB≥30%，DL≥0.18的标准进行筛选，经过去重处理，除去45个重复成分，最终筛选出195个有效成分。将这195个有效成分与中药构建中药-成分(Herbs-Compounds,H-C)网络(图1)，图中各成分大小按度中心性(degree)显示，其数值越高，图形显示越大，并进行网络拓扑分析，根据介数中心(betweenness centrality)排列，筛选出其中最高的前五位有效成分，其分别为β-谷甾醇(beta-sitosterol，MOL000358)、谷甾醇(sitosterol，MOL000359)、山柰酚(kaempferol，MOL000422)、槲皮素(quercetin，MOL000098)、豆甾醇(stigmasterol，MOL000449)。

图1 中药-成分(H-C)网络Figure 1 Chinese medicine-ingredients (H-C) network

2.2 药物与疾病靶点的Venn图建立

通过TCMSP数据库收集定喘汤中有效成分的相关作用靶点，经剔除无效及重复靶点，共收集到331个有效药物靶点。此外，通过在GeneCards数据库中检索哮喘相关靶点并经过相关性得分筛选，共得到1 661个疾病相关靶点。通过对两者有效靶点的Venn分析，共得到定喘汤潜在作用于哮喘疾病的164个靶点基因，如图2所示。

图2 Venn图Figure 2 Venn diagram

2.3 PPI网络构建

将药物与疾病共同靶点导入STRING数据库，得到药物-疾病靶点PPI网络图(图3)；其中全部164个靶点皆参与了 PPI 网络，无未参与蛋白互作的靶点，其中3 379条连线代表了靶点之间复杂的相互作用关系，线条越粗则表示作用越强，最后将其结果保存为 TSV 格式。

图3 药物-疾病靶蛋白PPI网络Figure 3 PPI network for drug-disease target

2.4 关键靶点筛选

通过将上述PPI网络的TSV格式文件导入Cytoscape 3.7.2软件，经网络拓扑属性分析，选取Degree和Betweenness同时在平均值之上的靶蛋白作为定喘汤的关键靶点。如图 4、5 所示，其平均度值为41.2，平均介数值为 5.1×10-3，通过筛选度值、介数值均超过平均值的靶点，共得到34个靶点(见表1)，这些靶点在PPI网络中处于关键位置，可能是定喘汤发挥作用的关键所在。将其筛选得到的关键靶点导入STRING数据库进而得到关键靶点的PPI网络图，如图6所示，在PPI网络中，一个节点的度(Degree)表示网络中和节点相连的路线条数。这些连接靶点较多的节点在整个网络中起到关键的作用，根据节点的Degree绘制出其关键靶点节点的条形图(图7)，其中排名前12位的关键靶点均与33个蛋白发生相互作用，分别为AKT1、ALB、CASP3、CXCL8、EGF、IL6、MAPK1、MAPK3、MAPK8、PTGS2、STAT3、VEGFA。

图4 度值Figure 4 Degree

图5 平均介数值Figure 5 Betweenness

图6 关键靶蛋白PPI网络Figure 6 PPI network for key target

图7 关键靶点节点的条形图Figure 7 Bar graph for key target

表1 (续)

表1 定喘汤关键靶点Table 1 Key target for Dingchuan decoction

2.5 “中药-化学成分-关键靶点”图绘制

通过 Cytoscape3.7.2 软件将中药、化学成分及关键靶点相连，绘制出“中药-化学成分-关键靶点”相互作用网络图，见图8。其中蓝色代表关键靶点，紫色代表各中药简称，黄色代表化学成分，通过分析发现，该网络图由238个节点和691个边组成。其中节点代表中药、化学成分和关键作用靶点，边代表三者之间的相互作用关系。在中药与关键靶点的对应关系中，普遍存在多种中药共有多个靶点。在化学成分与关键靶点的对应关系中，普遍存在一个化学成分有多个靶点及多个化学成分对应同一靶点的特点，从而证实了定喘汤是通过多途径、多靶点相互作用来发挥治疗效果的。

图8 “中药-化学成分-关键靶点”相互作用网络图Figure 8 "Chinese medicine-chemical composition-key target" interaction network

2.6 GO富集与KEGG通路富集分析

将34个关键靶基因通过采用R-3.6.1及perl脚本进行 GO 和 KEGG 富集分析。该富集分析过程中，共获取65个GO条目，根据P值<0.05，取排名前20的条目建立条形图(见图9)。其过程主要涉及细胞因子受体结合、受体配体活性、生长因子受体结合、RNA聚合酶II转录因子结合、激活转录因子结合、磷酸酶结合、趋化因子受体结合、MAPK激酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性等方面。基于以上几个主要方面，可以推测定喘汤的平喘作用可能是一个复杂的多途径协同作用的结果。此外共获取151个KEGG通路，根据P值<0.05，取排名前 20 的通路建立气泡图(见图 10)，其主要涉及IL-17信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路、Th17细胞分化、PI3K-Akt信号通路、T细胞受体信号通路、JAK-STAT信号通路、MAPK信号通路、Th1和Th2细胞分化、NF-κB信号通路、AMPK信号通路、癌症通路等，说明该方化学成分可干预部分通路来达到治疗哮喘的目的。

图9 GO富集条形图Figure 9 Bar graph for GO enrichment analysis

图10 KEGG通路富集气泡图Figure 10 Bubble chart for KEGG enrichment analysis

3 讨论

本研究得出定喘汤有效化学成分195 种，并根据介数中心值排列，其中β-谷甾醇、豆甾醇为甾醇类物质，山柰酚、槲皮素为黄酮类物质。已知β-谷甾醇在抗炎、免疫调节等方面具有显著效果，其在某些方面可提高抗炎因子IL-10的活性，减小趋化因子和促炎因子活性，同时可抑制核转录因子(NF-κB)迁移，其抗炎机制是通过减少NO的合成，抑制IL-6活性，减少IL-1、TNF-α等炎性因子的分泌[7]。豆甾醇具有显著抗炎作用，可显著降低炎症因子IL-1、IL-6、单核细胞趋化蛋白1以及环氧合酶2的mRNA表达[8]，还具有抗过敏疗效[9]。山柰酚、槲皮素具有很好的抗过敏、抗菌消炎作用[10],此外还有止咳平喘祛痰等功效[11]。

通过对药物与疾病164个共有靶点筛选，得到34个关键靶点，其中VEGFA为VEGF基因家族的一员，VEGF是一种多功能细胞因子，能有效舒张血管，增加血管内皮的通透性和促进细胞迁移，在哮喘呼吸道炎症和重塑中起着十分重要的作用[12]。白介素作为一类细胞因子，在哮喘发病中具有重要意义[13]，其中IL-2对嗜酸性粒细胞具有趋化作用；IL-4是IgE合成过程中最重要的调节因子；IL-6与其他因子共同作用，促进炎症和免疫反应，参与哮喘发病过程；IL-10能够抑制细胞因子合成，对哮喘治疗及其转归具有重要意义。STAT3是STAT家族的一员，能够调控Th17分化的因子，在哮喘发病中起着关键作用[14]。MMP9作为细胞外基质进行降解反应的限速酶，在呼吸道炎症反应及气道重塑过程中起着重要作用，在重症哮喘患者气道上皮细胞中具有高水平表达[15]。MAPK通过多种介质参与细胞增殖、分化、凋亡、应激反应、炎症反应及免疫防御等过程[16]。以上研究表明定喘汤是多靶点共同作用来发挥疗效的。

通过GO富集分析发现，定喘汤治疗哮喘的基因功能主要体现在细胞因子、生长因子、趋化因子、转录因子的活性及受体结合等方面。通过KEGG通路富集分析，可知定喘汤通过作用于多种通路达到治疗哮喘的目的。其中IL-17在气道炎症及气道重塑方面具有重要作用，与支气管哮喘的发生、进展及康复有显著联系[17]。PI3K信号通路在哮喘发病机制中体现在影响气道平滑肌细胞増殖和嗜酸性粒细胞聚集以及通过调节其聚集、活化、凋亡而影响气道炎症反应方面[18]，PI3K信号通路的蛋白表达水平与支气管哮喘的病理进程有着紧密联系[19]。此外PI3K/Akt信号通路在哮喘气道重塑方面具有重要影响，临床试验提示阻断该通路可通过多种机制抑制小鼠气道重塑[20]。研究发现哮喘儿童血液中TNF水平高于正常儿童，TNF参与哮喘发作期气道炎症的形成，可作为哮喘缓解期患儿炎症持续的重要指标[21]。其中TNF-α可诱发和加重哮喘，还可引起神经源性炎症及诱导多种细胞因子产生，从而引起发病过程中多种炎性细胞及炎症组分的级联反应，进一步引起气道重建[22]。Toll样受体作为固有免疫家庭中的模式识别受体，参与人体抵御病原入侵的第一道屏障，通过分布于细胞表面识别某些微生物进而激发哮喘发作或恶化病情[23]。当不同诱因刺激导致哮喘发作时，机体能够激活不同损伤性和(或)保护性Toll样受体相关通路，通过启动气道炎症反应、过敏性免疫反应及氧化应激反应等与其他通路共同调节哮喘的转归[24]。Harrington等[25]于2005年首次发现Th17细胞，其具有很强的促炎作用。已知Th17分化受多种细胞因子及转录因子的多重调节，包括IL-1β、IL-6、IL-21等均参与促进T细胞向Th17分化的过程[26]。此外STAT3能够在IL-6刺激下活化，进一步激活RORγt，从而促进Th17分化，IKKα作为NF-κB家族中的成员，也参与调节Th17分化[27]。普遍认为Th2优势分化的Th1/Th2 比例失衡是哮喘主要的发病机制。研究发现Th17和调节性T细胞的比例失衡也是其发病机制中的重要环节[28]。MAPK在哺乳动物细胞中存在ERK、JNK、p38MAPK等14条信号通路[29]，MAPK信号转导途径通过调控免疫/炎症细胞以及气道结构细胞诱发哮喘，引发气道高反应和气道重塑，造成Th1/Th2免疫应答失衡[30]。JAK-STAT信号通路普遍存在于脊椎动物中，白介素等细胞因子通过该通路传导信号，此外还协同P13K/AKT/mTOR及MAPK/ERK信号通路共同参与调节多项生物活动，该通路紊乱则导致多种免疫相关疾病的发生[31]。研究发现NF-κB信号通路在气道中被过度活化而导致哮喘患者发病，激活后的NF-κB不仅在炎症反应早期即发生作用，还能引起多种细胞因子的表达，加重气道炎症反应和气道重塑[32]。

综上所述，本研究通过分析定喘汤药理作用机制，推测其为多成分、多靶点、多通路共同作用发挥治疗效果，为后续实验研究的深入化提供了客观理论依据，也为定喘汤在今后药物研发等方面提供基础理论支撑。