益肾泄浊法对糖尿病肾病大鼠Col IV、FN蛋白及基因表达的影响

邵燕燕，郑晓静，薛化成，梁祎，甘旗旗，焦畔畔

(西安市中医医院肾病科，陕西 西安 710021)

糖尿病常常伴有糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)的发生，而且DN会导致终末期肾病的发生[1-3]。根据国际糖尿病联合会的统计，到2030年，DM的数量将继续增长，中印两国的增长幅度更大。糖尿病有将近35%的患者死于尿毒症，而糖尿病肾病的发生率也有将近1/4左右，因此需要急切找到防治DN的办法。

中医药理论认为，DN主要病机为气阴不足，脾肾两虚，瘀血阻络，湿浊不化，临证多采用益气养阴，健脾补肾，化瘀泻浊的基本治法。 “三消一证，……其实不越阴亏阳亢，津涸热淫而已”，阴虚热盛后，灼津伤精，浊瘀滞结，消渴则发，瘀气聚眼则发眼疾，扰乱心脏。“五脏之伤，穷必及肾”[4-6]。陶兴等[7]认为，瘀血聚体，病及肾脏。肾脏是胃的关键，肾气受损，必殃及胃。消渴日久，必害其肾，精气下泄，浊毒及发。

临床上多采用益气养阴、健脾补肾、泄浊化瘀的方法来治疗糖尿病肾病。益肾泄浊法标本兼治，临床应用多年，具有缓解症状，降低血糖、血脂、延缓DN病变等优势和特色。为了明确益肾泄浊法防治大鼠DN的生物学机制，本课题组拟探讨其与大鼠胶原蛋白Ⅳ(Col Ⅳ)、纤维粘连蛋白(FN)和基因[8]表达的关系，以期揭示其作用规律并为中医药防治DN的分子生物学机制研究提供新思路。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠购于西安交通大学实验中心，体质量180～220 g，生产许可证号SCXK (陕) 2017-003。

1.2 药物与试剂

按照药典规定购买益肾泄浊法相关药材(黄芪、丹参、益母草、女贞子、旱莲草、茯苓、猪苓、芡实、地龙等)，经西安交通大学药学院窦建卫副教授鉴定为正品；RNA逆转录试剂盒(北京康润诚业生物科技有限公司，批号8BC01)；链脲佐菌素(STZ)、抗体、Collagen Ⅳ、FN、β-肌动蛋白(美国细胞信号技术公司)。

1.3 主要仪器

CFX ConnectTM型Real-time PCR仪(美国Bio-Rad公司)； Centrifuge 5424R型冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；PowerPacTM型电泳仪电源、Trans-blot型转印槽、Genegnome XRQ型专业化学发光成像系统(中国基因有限公司)；DS-11型超微量分光光度计(中国倍辉科技有限公司)；ECLIPSE Ts2型倒置显微镜(日本尼康公司)。

2 方法

2.1 药液制备

黄芪60 g，丹参25 g，地黄和女贞子各20 g，丹皮、地龙和泽泻各10 g混合组成处方，将处方内容制备成质量浓度为0.9 g生药/mL的剂量进行实验。

2.2 大鼠DM模型的建立与分组

实验前，所有大鼠禁食12 h，自由饮水。大鼠在无菌条件下，按照60 mg/kg的剂量在右下腹部注射STZ，以诱导DM，用柠檬酸缓冲液处理空白对照。30 min后进食，72 h后，从尾部收集血液测量血糖。随机血糖大于16.7 mmol/L，饮用水的量和排尿量显著增加则表示造模成功[9-11]。造模前按体质量排序随机分为空白对照组(Con)，将造模成功的大鼠按血糖排序并编号，以使各造模组血糖值差异无统计学意义，采用分层随机分组法分为：模型组(DM)、阳性药物对照组(氨基胍组，AG)、益肾泄浊法组方高剂量组(SQC-H)、中剂量组(SQC-M)、低剂量组(SQC-L)，每组各10只，各组随机编为1～10号并做相应标记。造模成功1周后，开始给药。SQC-H组、SQC-M组、SQC-L组分别按6 g生药/kg、3 g生药/kg和1.5 g生药/kg给予益肾泄浊法组方药液，Con组和DM组则每千克给予20 mL蒸馏水，每天上午8～9点进行灌胃，持续16周；阳性药物组给予氨基胍3 g /kg。

2.3 生化检查

收集大鼠尿液和血液检测血尿素氮(BUN)、糖化血红蛋白(HbA1c)、24 h尿蛋白(Alb)、血肌酐(Scr)。

2.4 光镜检查

苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色后进行光镜检查[12]。

2.5 Western blot检测Col IV、FN蛋白表达

处死大鼠前，禁食12 h，麻醉，切除左肾，称质量并储存于液氮中，按照蛋白质提取试剂盒说明提取蛋白。电泳每孔上样20 μg，转膜、封闭、放过夜。次日，加入一抗(1∶1 000)，孵育2 h，洗涤5次，再加入二抗，室温孵育2 h，添加ECL发光溶液，参照蛋白为β-actin蛋白。

2.6 Real-time PCR检测Col IV、FN mRNA表达

处死大鼠前，禁食12 h，麻醉，切除左肾，称质量并储存于液氮中，再提取总RNA，使其纯度符合要求。逆转录时加入1 μg的RNA样品、5×Primer Script RT Master Mix无RNase水至10 μL，轻轻摇动使其均匀混合，进行反应。37 ℃下反应15 min，反应后的产物cDNA储存在-20 ℃的冰箱中。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠肾功能相关生化指标的变化

表1所示，与Con组相比， DM组BUN、HbA1c、Alb、Scr显著升高(P<0.05)。与DM组比较，SQC高、中、低剂量组的HbA1c明显降低(P<0.01)，SQC-H组能显著抑制BUN、Scr、尿蛋白的升高(P<0.05)，而SQC-L组作用不显著(P>0.05)。

表1 各组生化指标的变化Table 1 Changes of biochemical indexes in each group

3.2 各组HE染色结果

结果见图1。Con组肾小球结构清晰，无扩大和萎缩，肾小管管壁无塌陷、无增厚，系膜细胞无增生现象；DM组部分肾小球明显增大，产生更厚的肾小囊壁和更多的系膜细胞，肾管状上皮细胞产生空泡样的病变；与DM组相比，SQC组肾小球趋于正常，但系膜区仍变大，细胞数量增加，体积明显减小，SQC-H组的结构接近正常。

A. Con组； B. DM组； C. SQC-H组； D. SQC-L组。

3.3 各组大鼠肾皮质中Col IV、FN蛋白的表达结果

如图2、图3所示，参照β-actin蛋白条带的大小和颜色深浅，并与模型组相比，益肾泄浊法高、中、低剂量组的条带较小，颜色浅，表明益肾泄浊法能使糖尿病肾病大鼠Col IV、FN蛋白表达减少。

1. Con组； 2. DM组； 3. AG组； 4. SQC-H组； 5. SQC-M组； 6. SQC-L组。

与Con组比较：#P<0.05；与模型组比较：*P<0.05。

3.4 各组大鼠肾皮质中Col IV、FN mRNA的表达结果

如图4所示，与模型组相比，益肾泄浊法高、中、低剂量组mRNA相对表达量较低，高剂量组最显著，表明益肾泄浊法能减少糖尿病肾病大鼠Col IV、FN mRNA的表达。

与Con组比较：#P<0.05；与模型组比较：*P<0.05。

4 讨论

中医学上认为阴虚和燥热常常会引发糖尿病肾病，特别是阴虚。阴虚则热盛，二者因果并存，消渴日久，阴虚则损阳，阳虚则致寒，血液流淌不畅，瘀血阻滞，即“瘀血化水，亦发水肿，是血病兼水病也”。消渴日久，则为水肿[7]。长期患病会伤及肾，脾肾虚弱则使气不调。因此，在DN的临床治疗中，疾病分化应与综合征分化相结合，通过益肾和净化浊度为关键。

益肾泄浊法组方由黄芪、丹参、益母草、女贞子、旱莲草、茯苓、猪苓、芡实、地龙等药物组成，方中黄芪兼具益气补肾、利水化浊之功，与DN脾肾气虚、湿浊阻滞之机契合，故为君药；丹参和益母草组合使用，可以消除血液停滞和激活血液循环，促进利尿，还能消肿；女贞子、旱莲草、茯苓、猪苓、芡实合用，补益肝肾，健运脾胃，活血利水，是为佐药；地龙能利小便而助泄浊、通经络而助祛瘀，瘀浊内蕴，久易化热，性咸寒又可清热解毒，是为使药。全方共奏健脾益肾、泄浊通瘀之功，切中病机，行之有效，是我科用于治脾肾两虚、瘀浊阻滞所致的DN的良方[13]。

多种信号转导和转录因子都与DN的发生密切相关，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)、蛋白激酶C、受体酪氨酸激酶信号转导等[14-15]。Col IV蛋白是一种胶原蛋白，其在肾小球的异常增多会造成肾小球疾病[16]，研究表明中药黄芪能减少肾脏中Col Ⅳ蛋白的产生[17]，而本实验处方中黄芪是君药，对抑制Col IV蛋白产生起到重要作用。FN蛋白含量的增加，提示可能有肾脏纤维化的发生[18]。有研究表明，DN小鼠肾脏Col IV和FN蛋白的表达量明显升高[19]，Col Ⅳ和FN蛋白是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)主要成分蛋白，Col IV、FN合成增加会加剧ECM的集聚，加速DN的进展[20]，肾功能不全以及肾小球形态学的改变是常见的肾脏疾病，糖尿病ECM的集聚则会加重疾病的发生[21]。在本实验中，益肾泄浊法高、中剂量组能显著降低大鼠尿液和血液中的血BUN、Scr、HbA1c和24 h尿白蛋白，并且可以降低大鼠肾脏Col IV和FN蛋白的表达；与模型组相比，益肾泄浊法高、中、低剂量组均能使Col IV、FN蛋白和mRNA的表达量减少，可以防治DN病情的发展，为临床应用提供了一定的实验支持。但是DN病发病机制错综复杂，涉及多种靶点和通路的共同作用，需要在进一步实验中探索，完善其生物学机制。