百合浸出物提取方法的优化及其质量标准研究

崔婷，严玉晶，黄贵发，丁青，钟志奎，刘燎原

(广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244)

百合为百合科植物百合LiliumbrowniiF.E.Brown var.viridulum Baker、细叶百合LiliumpumilumDC、卷丹LiliumlancifoliumThunb.的干燥肉质鳞叶，主要功效为养阴润肺、清心安神[1]。百合主要化学成分为甾体皂苷类、酚类、生物碱类及其多糖类等[2-5]。现代药理研究表明，百合有明显的止咳祛痰、抗抑郁、镇静催眠、抗氧化等作用[6-9]。2015年版《中国药典》仅规定了冷浸法下百合水溶性浸出物量、外观性状以及薄层鉴别等[10]，缺少指标成分含量的测定或特征图谱等量化控制标准。因此，本研究拟采用HPLC法对百合浸出物提取方法及溶剂进行进一步的考察，结合百合浸出物指标成分含量及特征图谱，优选百合浸出物最佳提取工艺，为进一步完善百合浸出物的质量标准提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters H-Class型超高效液相色谱仪(Waters公司)；ME203E千分之一天平(Mettler Toledo公司，Max=220 g，d=0.001 g)；ME204E万分之一天平(Mettler Toledo公司，Max=220 g，d=0.000 1 g)；XP26型百万分之一电子天平(Mettler Toledo公司，Max=22 g，d=0.001 mg)；实验室Milli-Q超纯水系统(默克股份有限公司)；111B型二两装高速中药粉碎机(浙江瑞安市永历制药机械有限公司)；TC-15套式恒温器(海宁市新华医疗器械厂)；HWS28型电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；DHG-9147A电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 材料

王百合苷B(批号：114420-67-6，成都普菲德生物技术有限公司，纯度：98.0%)；百合药材共12批，均为自采药材，经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定为百合科植物卷丹LiliumlancifoliumThunb.的干燥肉质鳞叶，具体信息见表1。

表1 百合样品信息Table 1 The information of Lilii Bulbus samples

1.3 试剂

乙醇(批号：SY21905018，分析纯，西陇科学股份有限公司)；水为超纯水；甲醇(批号：SY21905021，色谱纯，默克股份有限公司)；乙腈(批号：SY21905022，色谱纯，默克股份有限公司)；磷酸(批号：SY21903010，色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 浸出物提取方法的建立

2.1.1 热浸法 取供试品S10约4 g，精密称定，置250 mL锥形瓶中，分别精密加入水和50%、75%、95%(体积分数，下同)乙醇各100 mL，按2015年版《中国药典》通则2201项下浸出物测定法中的热浸法提取，每组溶剂平行3份。

2.1.2 冷浸法 取供试品S10约4 g，精密称定，置250 mL锥形瓶中，分别精密加入水和50%、75%、95%乙醇各100 mL，按2015年版《中国药典》通则2201项下浸出物测定法中的冷浸法提取，每组溶剂平行3份。

2.2 百合浸出物含量及特征图谱测定方法的建立

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18Column(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；检测波长：205 nm；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；流动相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～4 min，1%～15%A；4～8 min，15%～28%A；8～12 min，28%A；12～12.1 min，28%～1%A；12.1～20 min，1%A)。

2.2.2 对照品溶液的制备 取王百合苷B对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含王百合苷B为643.2 μg的溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 浸出物：分别取“2.1.1”和“2.1.2”项下热浸法和冷浸法续滤液，即为供试品溶液。药材：取本品粉末约2 g，精密称定，加入稀乙醇25 mL，称定质量，超声处理(功率300 W，频率45 kHz)30 min，放冷，再称定质量，加入稀乙醇补足损失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 取稀乙醇溶液，过0.22 μm滤膜，即为阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 分别吸取上述对照品溶液、药材供试品溶液及阴性溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，结果显示阴性对照溶液在王百合苷B位置无吸收，表明阴性对照溶液无干扰，见图1。

图1 对照品溶液(A)、阴性对照溶液(B)、供试品溶液(C)HPLC图Figure 1 HPLC chromatograms of reference substance (A),negative sample (B) and the sample (C)

2.3.2 标准曲线的制备 分别精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液各1 mL，置于2、5、10、25、50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得质量浓度分别为321.6、128.6、64.32、25.73、12.86 μg/mL的系列对照品溶液。分别精密吸取上述系列对照品溶液及对照品原溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样1 μL，记录色谱峰面积。以对照品溶液质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得线性方程Y= 3 004.8X- 13 655，r=0.999 1，表明王百合苷B质量浓度在12.86～643.1 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 日内精密度：吸取“2.2.3”项下同一药材供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，以王百合苷B色谱峰为参照峰S，计算各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值，结果相对保留时间的RSD均小于0.2%，相对峰面积的RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好。日间精密度：吸取“2.2.3”项下同一药材供试品溶液，分别在不同日期内按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，以王百合苷B色谱峰为参照峰S，计算各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值，结果相对保留时间的RSD均小于0.1%，相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 精密吸取“2.2.3”项下同一供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、8、12 h测定，结果各共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.2%，相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 按“2.2.3”项下方法平行制备同一供试品溶液6份，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果各共有峰的相对保留时间的RSD值均小于0.1%，相对峰面积的RSD值均小于3.0%，表明方法重复性较好。

2.3.6 加样回收率试验 取百合药材样品(王百合苷B质量分数为1.960 mg/g)9份，每份约1 g，精密称定，按供试品中指标成分量与加入对照品量之比为1∶0.5、1∶1、1∶1.5原则分别加入适量的王百合苷B对照品，按“2.2.3”项药材制样方法制备供试品溶液，并按“2.2.1”项的色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表2。可见，王百合苷B的平均回收率为97.36%，RSD值为1.70%，表明方法回收率较好。

表2 王百合苷B加样回收率试验结果Table 2 The Recovery results of regaloside B

2.4 不同提取溶剂及提取方法对浸出物量的影响

按2015年版《中国药典》通则2201项下浸出物测定方法，分别精密量取“2.1”项下不同提取方法及不同提取溶剂下样品溶液25 mL置蒸发皿中，水浴锅蒸干后，于105 ℃条件下烘3 h，称定干燥品质量，以干燥品计算供试品中得到的浸出物量(%)，浸出物量=干燥品量/取样体积×总体积/样品取样量×100%，结果见表3。结果表明，热浸法下，不同溶剂提取的百合浸出物的量均高于冷浸法，浸出物量顺序为水>50%乙醇>75%乙醇>95%乙醇。

表3 不同提取溶剂及提取方法对浸出物量的影响Table 3 The extract amount of Lilii Bulbus in different extraction methods and solvents(n=3) w/%

2.5 不同提取溶剂及提取方法对王百合苷B质量分数的影响

分别取“2.2.3”项下浸出物的供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件对百合不同提取方法、不同提取溶剂下浸出物中指标成分王百合苷B质量分数进行测定，按干燥品计算浸出物中王百合苷B质量分数，结果见表4。

表4 不同提取溶剂及提取方法对王百合苷B质量分数的影响Table 4 The content of regaloside B in different extraction methods and solvents(n=3) w/%

结果表明，提取溶剂为50%乙醇、75%乙醇时，提取方式对浸出物中王百合苷B质量分数无明显影响，以水和95%乙醇为提取溶剂时，热浸法优于冷浸法。

2.6 不同提取溶剂及提取方法对浸出物特征图谱的影响

分别取“2.2.3”项下浸出物的供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱方法对百合不同提取方法、不同提取溶剂下浸出物的特征图谱进行测定，记录各共有峰面积，计算共有峰总面积结果见表5，色谱图见图2。可见，不同提取方法及提取溶剂下，主要特征峰基本一致，但共有峰总面积存在较大的差异，热浸法共有峰总面积基本高于冷浸法，提取溶剂为95%乙醇时，共有峰峰2无法测出。

表5 不同提取溶剂及提取方法对浸出物特征图谱的影响(n=3)Table 5 The area of common peaks of the characteristic spectrum in different extraction methods and solvents

图2 不同提取溶剂及提取方法百合浸出物的HPLC图Figure 2 The HPLC of Lilii Bulbus extract in different extraction methods and solvents

2.7 百合浸出物提取方法评价

由于百合中含有较多的淀粉、糖及黏液质，样品过滤时会影响过滤速度，从而对不同提取方法及提取溶剂结果产生一定的影响，因此，本研究以浸出物量、指标成分含量、特征图谱共有峰总面积、过滤速度作为评价指标，总分5分，并按照以上指标依次打分，最高5分，最低1分，按照系数0.3∶0.3∶0.2∶0.2计算不同提取方法及提取溶剂下的综合分。加权总分=浸出物得分×0.3+含量得分×0.3+共有峰总面积得分×0.2+过滤速度得分×0.2，结果见表6。

表6 综合得分评价表Table 6 The evaluation table of comprehensive scores

加权计算结果显示，热浸法75%乙醇得分最高，故选定百合浸出物提取方法为：热浸法，以75%乙醇作提取溶剂。

2.8 百合浸出物质量标准的建立

按以上得出的最佳提取溶剂及提取方式，即热浸法、以75%乙醇为溶剂，对“1.2”项下各批次百合药材进行浸出物测定，采用SPSS26.0软件对12批不同产地浸出物测定结果进行差异性分析，结果见表7、图3。

表7 不同产地百合各个指标测定结果(n=2)Table 7 The various indicators results of Lilii Bulbus from different origins

图3 不同产地百合各指标对比分析图Figure 3 The charts of comparative analysis of Lilii Bulbus from different origins

可见，上述12批不同产地百合间的药材王百合苷B质量分数、醇溶性浸出物量、浸出物中王百合苷B质量分数及浸出物特征图谱共有峰面积的差异无统计学意义，12批百合药材浸出物量波动范围为8.62%～11.62%，均值为10.03%，醇溶性浸出物中王百合苷B质量分数波动范围为1.492%～2.408%，均值为2.102%，表明上述4个不同产地百合质量较均一、稳定。考虑到药材取样的代表性与质量的波动性及制定标准的广泛适用性，在制定百合醇溶性浸出物量及浸出物中王百合苷B质量分数时以平均值下浮30%确定百合醇溶性浸出物不低于7.0%，浸出物中王百合苷B质量分数不低于1.471%。

3 讨论

百合是一种药食同源的中药，资源丰富，文献研究表明百合主要化学成分为甾体皂苷类、多糖类、生物碱类、黄酮类、氨基酸及磷脂等，主要成分为甾体皂苷及多糖类等大极性成分[2-5]。2015年版《中国药典》收载百合的鉴别项目为冷浸法下以水为溶剂进行浸出物测定，但百合中含糖类及黏液质较多，冷浸后，溶液黏性较大，难过滤，需进行抽滤操作，且在过滤过程中损耗较大。浸出物测定过程中，浸出物量反映了药材提取程度，指标成分含量及特征图谱可以很好地反映药材提取过程中量和质的变化，故本研究以水及不同体积分数乙醇为溶剂进行考察，以浸出物量、浸出物中王百合苷B质量分数、HPLC图谱特征峰总面积、溶液过滤速度作为综合评价指标优选百合浸出物最佳提取工艺，结果显示，以热浸法下75%乙醇为溶剂，加权评分最高，宜作为百合醇溶性浸出物的提取溶剂及方法。

本研究按优选的提取方法对不同产地的12批百合药材的浸出物量、浸出物中指标成分王百合苷B质量分数及特征图谱进行测定，结果显示不同产地百合浸出物质量整体较稳定，无明显差异。本研究建立的百合药材浸出物及特征图谱测定方法，为百合药材质量的控制提供有益的参考依据，并对百合浸出物质量标准的建立提供了数据支持。