不同食物源中乳酸菌的分离及酸奶发酵性能研究

郑天宇，彭帅，杨小玲，朱雪蕾，吴慧昊

（西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030）

酸奶是以牛（羊）乳或乳粉为主要原料，杀菌后添加乳酸菌发酵而成的发酵乳制品[1]。因其独特的风味和丰富的营养多年来一直受到广大消费者的青睐[2]。它不仅保留了牛乳中所有的营养成分，而且还因发酵作用产生大量的乳酸及有益于人体健康的活性乳酸菌[3]。酸奶能有效促进人体消化，增强机体对乳糖的吸收[4]，促进机体物质代谢及维持肠道内菌群的平衡，经常饮用酸奶具有提高人体免疫力、降低血中胆固醇等功效[5～8]。而且酸奶发酵过程中，牛奶中的糖和蛋白质等营养成分有20%左右被分解成小分子，更易消化和吸收，各种养分的利用率也得以提高[9]。

发酵剂是决定发酵乳制品品质的重要因素，也是酸奶产酸和产香的基础和关键因素。酸奶质量的好坏主要取决于酸奶发酵剂的品质类型及活力[10]。甘肃省有丰富的牛乳资源，当地牧民沿袭传统的方法制作的乳酸奶产品风味独特，组织状态细腻，口感优良，牧民经常食用，大多健康长寿[11]。这表明当地酸牛乳中有性能优良的乳酸菌群[12]。本研究采集牧民传统制作的酸牛乳与泡菜，对其中的乳酸菌种进行分离纯化及发酵性能的测定，以期筛选出性能优良的乳酸菌菌株用于酸奶生产。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种：厌氧微生物实验室保存的菌株：植物乳杆菌、双歧杆菌、戊糖片球菌、戊糖乳杆菌、ZT010T；分离自泡菜制品、牧民自制酸奶的乳酸菌株。

1.1.2 原料：纯牛乳。

1.1.3 培养基：

乳酸细菌（MRS）液体培养基（g/L）：蛋白胨 10.0g、牛肉浸粉10.0g、酵母浸粉5.0g、柠檬酸三铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温-80 1.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1L，pH6.6-6.8，1×105Pa灭菌20min。MRS固体培养基：在上述液体培养基的基础上加入20g/L碳酸钙、17.5g/L琼脂。

1.1.4 仪器与设备

M L S-3 7 5 0 全自动高压灭菌器（J A P A N SANYO），GL-21M高速冷冻离心机（赛特湘仪离心机仪器有限公司）。BX51T-32P01 数码光学显微镜（OLYMPUS .JAPAN）；1285 生物安全柜（Thermo Electron Corporation）。

1.2 方法

1.2.1 样品采集

采自甘肃省甘南州牧民家庭自制酸奶及泡菜制品，共采集5份。取样后将其放入无菌瓶中，储存于冰盒中，并于48h内送至实验室用于菌株的分离、筛选。

1.2.2 发酵菌的分离及纯化

取乳样及泡菜制品各1mL，采用梯度稀释法将酸奶稀释至10-8，将泡菜制品稀释至10-6。取0.2mL稀释样品，平板涂布于含有碳酸钙的MRS培养基上。于37℃倒置培养，48h后观察菌株生长情况。在培养基中挑选具有明显透明圈的菌落进行分离和纯化。并记录下培养基菌落总数。

根据菌落形态（大小、形状、颜色、边缘、光泽）对菌落进行命名[13]，挑选形态不同的菌落在MRS琼脂培养基上反复划线纯化培养直至镜检为纯菌株[14]。将纯化菌株置于4℃保存备用。

1.2.3 纯化菌株的形态学观察

挑纯化后的菌落进行简单染色，通过简单染色镜检图片记录各个菌落形态特征。

1.2.4 酸奶生产的简要工艺流程

纯牛乳→杀菌(煮至微沸)→ 冷却(室温)→分装→接菌→封口→发酵→ 后熟及冷藏(4℃)→成品[15]。

1.2.5 菌株初筛

将分离菌株在MRS液体培养基中活化后，以16%的接菌量接种于纯牛乳中，发酵培养，记录下凝乳时间、凝乳外观及乳清析出量。淘汰活力差、凝乳性能不好的菌株，筛选发酵性能优良的菌株进行后续实验[16]。

1.2.6 不同菌株发酵酸奶感官综合评定

将初筛选定的菌株分别以16%的接菌量接种于灭菌的纯牛乳中，发酵至凝乳，凝乳后后熟冷藏发酵24h，由10名食品专业人员（男女各半）品尝鉴别，评分标准为产品的特征，包括表层外观、组织状态、口感、乳清的析出等。评定标准如表1所示[17]。

1.2.7 不同温度下菌株发酵性能对比

将初筛选定的菌种以16%的接菌量接种于纯牛乳中，将其分别放置在37℃、40℃进行发酵培养，设置三个重复实验。凝乳后按照发酵乳感官评分标准进行评价，对比不同温度下菌株发酵性能的差异。

表2 分离菌株形态特征

2 结果与分析

2.1 菌株的分离结果

从牧民家庭采集的发酵乳样本及泡菜制品中共分离出6株发酵菌，其中杆菌4株、球菌2株，对分离出的菌株进行染色观察，具体结果见表2。图1～3为选取分纯菌中具有代表性形态特征菌株图片。

图2 杆C（10×100）

图3 杆D（10×100）

2.2 初级筛选结果

以分离活化出的6株乳酸菌及实验室保存的5株菌制备酸奶。根据发酵结果表现，淘汰发酵过程中活力弱、凝乳性能不好、发酵性能差的菌株，最终筛选出发酵性能优良的5株菌进行后续实验。5株菌分别为植物乳杆菌、戊糖片球菌、ZT010T、双歧杆菌、杆A。菌株发酵效果如表3所示，酸奶发酵结果如图4所示。

2.3 不同温度发酵实验

将初筛获得的5株菌种按照16%的接菌量接种于纯牛乳中，接种后的牛乳分别放到37℃、40℃发酵培养，设置三个重复实验。凝乳后对其组织状态、滋味及风味、色泽等指标做出评定[18]，按照表1的评分标准，取其平均值[19-20]。结果如表4、表5所示。发酵结果见图5、图6。

表3 菌株发酵效果

图4 酸奶发酵结果

由表4可以得出，37℃发酵时，5种菌株发酵酸奶都具有较为良好的发酵性能：双歧杆菌和ZT010T凝乳时间长，组织状态较差，口感粗糙；植物乳杆菌、戊糖片球菌以及杆A凝乳时间较短，有发酵香味且口感细腻，双歧杆菌和植物乳杆菌均无乳清析出且发酵色泽优良，戊糖片球菌、ZT010T、杆A均有少量乳清析出，戊糖片球菌以及ZT010T有结块现象，杆A色泽程度较其他发酵菌差。

表4 37℃发酵实验

图5 37℃发酵实验

由表5可以看出，在40℃发酵时，5种菌株发酵结果较37℃都有所改善，双歧杆菌发酵时间较长，产酸能力较好，组织状态较好；植物乳杆菌、ZT010T发酵时间较短，口感细腻，组织状态光滑，色泽优良；戊糖片球菌、杆A发酵时间也较短，色泽较好，产酸性能优良。

表5 40℃发酵实验

图6 40℃发酵实验

通过两种温度下酸奶发酵效果对比可以看出：37℃下凝乳时间与40℃相比有一定差异性，后者比前者在发酵时间上有一定程度的缩短。其中ZT010T前后差异较为显著。双歧杆菌是所有实验菌种中发酵时间最长的，但当温度改为40℃时，发酵时间也在一定程度上被缩短。ZT010T在不同温度前后的变化结果表明，升高温度在一定程度上可以改善乳清析出量以及组织状态。两组温度下感官综合评分结果对比表明，40℃发酵的酸奶色泽均匀一致、口感细腻、有浓郁的酸奶风味且几乎无乳清析出，各项指标综合评分较高，更为可口。

3 结论

从甘肃牧民家庭采集的酸牛乳及泡菜制品中共分离出6株乳酸菌，初筛后加上实验室保存菌种共得到5株发酵性能优良的菌种。这5株菌凝乳时间较短、生长活力较强、乳清析出较少。将分纯后的菌株分别在37℃以及40℃接入纯牛乳中发酵培养，从实验结果可以得出：温度波动对酸奶发酵特性和品质有影响。40℃发酵可以改善酸奶的乳清析出量、组织状态以及酸奶的风味，其感官总评分高于37℃时发酵总评分。