不同乳蛋白组分对牛乳酶凝乳特性的影响

2019-01-23 05:52赵爱梅罗天淇杨贞耐
乳业科学与技术 2019年1期
关键词:酪蛋白牛乳组分

赵 笑,赵爱梅,郑 喆,罗天淇,杨贞耐*

(北京工商大学食品学院,北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,食品添加剂与配料北京高校工程研究中心,北京 100048)

随着乳业的发展及奶牛数量的增加,牛乳中蛋白质组成随之变化,导致原料乳凝乳时间增加,凝乳质量变差,甚至出现牛乳不能凝固的情况。在乳制品生产过程中,因牛乳凝乳特性差或不凝乳而导致产品品质和产率下降是困扰乳品企业的突出问题[1]。原料乳的凝乳特性受到多种因素的影响,与奶牛的品种、年龄、胎次、泌乳期、季节和其他环境因素等相关,而这些因素主要通过影响牛乳的组成成分来影响牛乳的凝乳特性[2-3]。

酶凝乳是干酪生产的关键,酶凝乳时间的长短及酶凝乳后的凝胶强度均影响干酪的最终产量及品质。合理控制酶凝乳时间可以减少原料乳中脂肪、蛋白质等的流失,提高干酪的产率。一般来说,酶凝乳时间相同时,牛乳酶凝乳后凝胶强度越高,表明凝胶中干物质含量越高,有利于缩短后期凝乳收缩和压榨时间,提高干酪产量。酶凝乳的过程不仅受酶本身活性、pH值、加工过程等因素的影响,同时也受原料乳的影响,特别是原料乳中的蛋白组分(主要是κ-酪蛋白(κ-casein,κ-CN))。Ikonen等[4]利用酶凝乳特性不同的原料乳制作Emmental干酪,发现酶凝乳特性好的原料乳所得到的干酪产率较高,且干酪成熟后品质也优于酶凝乳特性较差的原料乳制作的干酪。另有研究显示,由于酶凝乳特性的差异,采用不同原料乳制作的干酪,其成熟后期的风味也会受到影响[5]。

牛乳的凝乳特性不仅与牛乳中的总蛋白质含量有关,且与乳蛋白组成存在着遗传相关性[6],而对于牛乳中不同蛋白组分与牛乳凝乳特性间的关系研究不多。因此,本研究旨在通过在牛乳中添加不同的乳蛋白组分,了解不同乳蛋白组分对牛乳酶凝乳特性的影响;通过分析酶凝乳差异性原料牛乳的差异蛋白组成,探讨与酶凝乳相关的乳蛋白组分,为实际生产中获得具有优良酶凝乳特性的原料牛乳提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

凝乳酶(食品级) 丹麦科汉森公司;乳清蛋白粉、酪蛋白粉 恒天然(中国)有限公司;α-乳白蛋白(α-lactalbumin,α-La)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LgA和β-LgB)、α-酪蛋白(α-casein,α-CN)、β-酪蛋白(β-casein,β-CN)、κ-CN标准品 美国Sigma公司;其他试剂均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DV-Ⅲ黏度计 美国Brookfield公司;S-3400N扫描电子显微镜 日本日立公司;CGS-3激光光散射仪北京赛普瑞生科技开发有限责任公司;Protean IEF Cell等电聚焦仪 美国Bio-Rad公司;LTQ-Orbitrap Velos质谱系统 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 不同乳蛋白组分对牛乳酶凝乳特性的影响

1.3.1.1 实验设计

配制质量浓度为10 g/100 mL的脱脂牛乳,分别添加质量分数0.80%的乳清蛋白浓缩物(whey protein concentrate,WPC)、CN、α-La、β-LgA、β-LgB、α-CN、β-CN和κ-CN,用于研究相同添加量的不同乳蛋白组分对牛乳酶凝乳特性的影响。

将WPC、CN、α-La、β-LgA、β-LgB、α-CN、β-CN和κ-CN标准品配制成相同质量浓度(5 mg/mL)的溶液,按100、200、300、400、500 μL/mL的添加量分别加入到脱脂牛乳中,用于研究不同添加量乳蛋白组分对牛乳酶凝乳特性的影响。

1.3.1.2 酶凝乳时间的测定

分别取10 mL添加不同乳蛋白组分的脱脂牛乳样品,在35 ℃条件下保温5 min,然后添加100 μL 0.1 mol/L无水氯化钙和0.002 g/100 mL凝乳酶,并迅速混合均匀,记录从添加凝乳酶到牛乳开始凝固的时间。

1.3.1.3 凝乳黏度的测定

在25 ℃条件下,利用黏度计测定添加不同乳蛋白组分的脱脂乳样品在酶凝乳后的黏度。选用转子型号为SC4-34,设定转速为100 r/min,剪切速率28 s-1;测定时间1 min,每隔5 s测定1 次,共测定12 次,取12 次测定结果的平均值作为最终黏度。

1.3.2 凝乳的微观结构观察

采用扫描电子显微镜(scanning electron microscope,S E M)观察凝乳的微观结构。参照H a q u e等[7]的方法,并有所改动。凝乳样品冷冻干燥后溶解,取5 μL样品,滴在洁净的盖玻片上,于自然条件下干燥,在盖玻片样品上滴加50 μL 2.5%、pH 6.8的戊二醛,4 ℃条件下固定3 h;用pH 6.8、0.1 mol/L的磷酸缓冲液清洗3 次,每次10 min;分别用体积分数为30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇进行脱水处理,每次10 min,用100%的乙醇冲洗3 次,其他体积分数的乙醇各1 次,100%乙醇中要加入吸水剂;用醋酸异戊酯对乙醇进行置换,每次5 min,共3 次;冷冻干燥后固定需要观察的面,采用离子渐射的方法镀金。最后用SEM进行观察。

1.3.3 动态光散射法测定酶凝乳过程中的酪蛋白分子粒径

利用NaH2PO4·2H2O和无水Na2HPO4配制0.2 mol/L、pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液,室温条件下用该缓冲溶液溶解牛乳酪蛋白;将牛乳酪蛋白和各乳蛋白样品稀释为质量浓度为0.1 g/100 mL的稀薄液体后,经0.45 μm滤膜过滤,在无尘条件下装入样品瓶待测。检测方法依据赵雯等[8]的方法,将样品瓶置于激光光散射仪样品室内,检测过程均在90 °角方向进行,632.8 nm波长处测定每个样品的平均流体力学半径分布情况。每个样品测定时间为10 min,以消除低光散射强度对测定的影响。

1.3.4 差异性原料牛乳的差异蛋白分析

1.3.4.1 差异原料牛乳的选择

本实验室在2013—2014年期间采集了217 头荷斯坦奶牛的新鲜原料乳样品,样品涵盖不同季节、生产胎次和泌乳期的奶牛所产牛乳,并对样品进行乳成分、电导率、pH值及酶凝乳时间的分析[9],根据分析结果,选取蛋白质及脂肪含量相同、但酶凝乳时间相差较大的2 个样品,依据Valentina等[10]的方法进行高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)分析。

1.3.4.2 双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)分析

原料牛乳样品在4 ℃条件下4 000 r/min离心20 min,去除上层脂肪;经0.22 μm滤膜过滤后放入裂解缓冲溶液中,充分反应后置于-20 ℃,待用。使用IPG胶条进行等点聚焦,聚焦程序为:30 V,12 h;500 V,1 h;1 000 V,1 h;8 000 V,4 h;2 000 V,10 h。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)参照《蛋白质技术手册》[11]中相关内容进行。其中分离胶浓度13.5%,电泳条件为恒流15 mA/块胶,15 min后加大电流,改为30 mA/块胶。避光条件下银染30 min,将脱色并经过蒸馏水浸泡的凝胶放入Pharos FX激光成像系统扫描,收集2-DE图谱,使用PDQuest软件进行图谱的定量比较分析。

1.3.4.3 差异蛋白质谱分析

1)胶内酶切、肽段提取

用干净的解剖刀将差异蛋白点凝胶胶点切成1~2 mm2大小的胶块放入EP管中;用100 μL 50%乙腈-25 mmol/L碳酸氢铵浸泡胶粒,超声10 min,弃去溶液,重复1~2 次至胶粒中蓝色褪尽;真空离心干燥至胶粒完全脱水,加入15 μL 10 ng/μL的胰蛋白酶(用25 mmol/L碳酸氢铵溶解),4 ℃条件下放置30 min,将多余酶液吸走或补充25 mmol/L碳酸氢铵覆盖胶粒,37 ℃条件下保温16 h;40 ℃条件下,用100 μL 5%三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)提取1 h,超声2 次,取上清;30 ℃条件下,用100 μL 2.5% TFA-50%乙腈提取1 h,超声2 次,取上清,合并2 次上清液,离心干燥。

2)纳升级反向色谱-LTQ-Orbitrap Velos轨道阱质谱分析仪分析

用20 μL 2%甲醇和0.1%甲酸混合溶液(体积比1∶9)将冻干的多肽复溶;12 000 r/min离心10 min,取上清上样(夹心法上样),上样体积10 μL;Loading Pump流速350 nL/min,15 min;分离流速350 nL/min,流动相A:0.1%甲酸水溶液;流动相B:0.1%甲酸-乙腈溶液,流动相分离梯度如表1所示;质谱母离子扫描范围为300~1 800m/z,二级碰撞模式为碰撞诱导解离(collision induced dissociation,CID)。

表 1 流动相分离梯度设置Table 1 Gradient mobile phase composition

3)质谱数据分析

本研究中选择的数据库来自NCBI,数据库版本为Refseq_Bos taurus _201508.fasta,采用Maxquant(Version 1.5.1.2)进行搜库分析。

2 结果与分析

2.1 乳中主要乳蛋白组分对牛乳酶凝乳时间及黏度的影响

2.1.1 不同乳蛋白组分对牛乳酶凝乳时间及黏度的影响

由图1可知:WPC、κ-CN、β-LgA和β-LgB对牛乳的酶凝乳有促进作用,其促进作用大小依次为WPC>β-LgA>β-LgB>κ-CN;CN、β-CN、α-CN和α-La对牛乳的酶凝乳有抑制作用,抑制强度依次为α-La>α-CN>CN>β-CN。邢世宇等[12]研究表明,β-Lg对产奶量和乳蛋白组成均有显著影响,进而影响牛乳的凝固特性。由于酶凝乳过程主要是凝乳酶水解κ-CN中苯丙氨酸和蛋氨酸(Phe105-Met106)之间的肽键生成副κ-CN和大分子肽链,导致酪蛋白胶粒负电荷的净数量和静电排斥作用下降,引起酪蛋白胶粒发生聚集,因此牛乳中κ-CN的含量或比例较低,则酶凝乳时间长,凝乳特性较差,相反,添加κ-CN会加快凝乳形成。与本研究不同的是,Wedholm等[13]的研究表明,不仅κ-CN和β-LgB对干酪产率有重要促进作用,αS1-CN及β-CN含量较高的原料乳制作的干酪产率也较高,这可能与原料乳本身的蛋白质组成差异有关。Isaya等[14]的研究表明,牛乳本身含有的乳清蛋白可以通过某种竞争性或非竞争性机制来抑制凝乳酶对κ-CN的水解,并通过形成一定的物理或空间障碍来降低酪蛋白胶束的聚集。本研究中添加乳清蛋白反而缩短了酶凝乳时间,促进了酶凝乳;添加酪蛋白则对酶凝乳有一定的抑制作用。这表明牛乳中添加不同的乳蛋白组分可能会影响酪蛋白的网络结构或酪蛋白胶粒表面的静电作用,从而影响其最终的聚集状态,这与原料乳本身蛋白质组分差异引起的酶凝乳特性不同有一定的区别。

2.1.2 乳蛋白组分含量对牛乳酶凝乳时间及黏度的影响

由表2可知,随着α-La、α-CN、β-CN或CN添加量的增加,牛乳的酶凝乳时间呈延长趋势,黏度降低,表明在本研究中,添加上述4 种乳蛋白组分会抑制牛乳的酶凝乳作用,且形成的凝乳块内部结构致密性下降,凝乳质量偏差。而随着β-LgA、β-LgB、κ-CN或WPC添加量的增加,牛乳的酶凝乳时间缩短,黏度增加,表明这4 种乳蛋白组分的添加对酶凝乳具有促进作用,且在一定范围内,适当增加这些组分的含量可以加快酶凝乳,同时提高凝乳质量。张媛等[15]的研究表明,随着β-CN脱除率的增加,牛乳酶凝乳后的黏性显著降低,弹性有所上升,凝胶结构疏松,但酶凝乳时间没有出现明显滞后,脱除β-CN不影响凝乳酶对κ-CN的降解。Holland等[16]的研究表明,脱除β-CN或乳清蛋白后的牛乳与正常牛乳相比,在酶作用下的凝胶形成时间显著延长,弹性有所上升。本研究表明,脱除牛乳中某种蛋白组分对酶凝乳质量的影响与外源性添加乳蛋白组分有所不同,外源添加β-CN会造成酶凝乳质量下降。

表 2 添加不同乳蛋白组分对脱脂牛乳酶凝乳特性的影响Table 2 Effect of adding different milk protein components on the rennet coagulation properties of skim milk

2.2 乳蛋白组分对牛乳酶凝乳微观结构的影响

由图2可知:添加β-LgA、β-LgB、κ-CN和WPC的酶凝乳样品微观结构连接紧密,形成的空穴较少且分布比较均匀,从而增强了空间稳定性,提高了凝乳质量;而添加α-La、α-CN、β-CN和CN的酶凝乳样品微观结构发生明显的改变,凝乳空间结构较疏松,形成的无序空洞结构较多且体积较大,结构稳定性较差,表现为凝乳质量变差。

2.3 乳蛋白组分对酪蛋白胶束凝固行为的影响

图3为添加不同乳蛋白组分的酪蛋白-酶凝乳体系在酶凝乳形成过程中颗粒分子半径的分布情况。根据光散射相关理论,小分子的半径变化由于大分子的存在而成为非主导因素,分布曲线中主要体现了大分子半径的变化。在相同时间段内,添加β-LgA、β-LgB、κ-CN和WPC的酪蛋白溶液在加入凝乳酶后,分子半径分布迅速发生变化,倾向于集中分布在约100 nm左右(图3B),表明溶液内部的蛋白质分子迅速发生聚集[17]。而添加α-La、α-CN、β-CN和CN的酪蛋白溶液中分子半径分布比较分散,分布区间较宽(图3C)。在凝乳酶催化牛乳凝乳的过程中,酪蛋白胶束中的κ-CN被水解,胶束发生凝聚。在本研究中,由于用极稀的酪蛋白溶液观测酶凝乳过程,因此推测蛋白质分子半径未发生明显增大的原因是稀释溶液中蛋白质分子间引力不足以形成稳定的凝聚结构,仍处于分散状态。

2.4 原料乳酶凝乳特性的差异性分析

牛乳中的乳蛋白含量和组成受多种因素的影响,而乳蛋白直接影响牛乳的凝乳特性[18]。为探究原料乳酶凝乳差异与乳蛋白组分之间的关系,本研究采集蛋白质和脂肪含量相近、酶凝乳时间差异显著(P≤0.05)(表3)的原料牛乳样品(分别编号为1253和12012)。对酶凝乳特性差异性原料乳样品进行反向HPLC分析。由图4可知:凝乳质量较好的样品1253中β-CNB和

表 3 酶凝乳特性差异性原料乳的脂肪、蛋白质、乳糖含量及酶凝乳时间Table 3 Fat, protein and lactose contents and curding time of raw milk with different coagulation properties

κ-CNA/E的含量明显高于凝乳质量较差的样品12012;2 个样品中αS1-CNB/C、β-CNA1和β-LgB的含量没有明显差别;样品12012中存在不同的β-CN变异体。

2.5 原料乳的2-DE差异蛋白图谱

采用2-DE方法对酶凝乳质量差异性乳样进行比较分析。由图5可知,乳样中的主要蛋白质组分为αS1-CN、αS2-CN、β-CN、κ-CN和β-Lg,凝乳较差的样品12012中存在较多的变异体。已有研究表明,α-La对牛乳酶凝乳特性具有显著影响,而在本研究中蛋白质印记未显示出差异,这可能是由于差异原料乳中不同基因型的α-La含量接近[19]。

2.6 质谱分析结果

对既有的乳蛋白2-DE图谱进行比较,识别出组分有差异的同种蛋白质进行深入比较,通过LTQ-Orbitrap Velos质谱对2-DE分析得到的差异蛋白数据进行搜库,识别出多个肽段信息。

表 4 酶凝乳特性差异性原料乳样品中的差异蛋白比较分析Table 4 Comparison of differential proteins in different milk samples

由表4可知,牛乳中的差异蛋白质均与奶牛的生理活动和代谢机能相关。属于κ-CN的差异蛋白质影响磷脂酰肌醇3-激酶的合成及活性以及蛋白质转运功能;属于αS2-CN的差异蛋白质包括3 组:第1组差异蛋白质影响相关基因表达及能量转换过程;第2组差异蛋白质影响细胞增殖及凋亡和蛋白质的合成及能量转化;第3组差异蛋白质主要影响结构分子活性,其中角蛋白与奶牛表皮发育情况有关。β-CN的差异蛋白质包括2 组:第1组差异蛋白质影响细胞膜的组成和蛋白质修饰:第2组差异蛋白质影响酰基鞘氨醇葡糖转移酶活性和DNA的翻译。奶牛乳腺上皮细胞具有合成和分泌乳汁的特殊功能,包括乳中脂肪和蛋白质等成分的合成和调控[20-21]。乳腺上皮细胞是乳成分生成过程中重要的物质和能量转化场所,而质谱分析结果所涉及的细胞功能与乳腺上皮细胞的生理功能紧密相关。对于产凝乳特性较差牛乳的奶牛,其牛乳蛋白质成分中含有较多的磷脂酰肌醇3-激酶前体和囊泡结合蛋白前体,其他差异蛋白质则含量较少。磷脂酰肌醇3-激酶[22]是一种与细胞内信号传导有关的脂类第二信使,能抑制多种急性细胞应答,与多种生物学事件有关,如囊泡运输、细胞骨架重组、细胞存活及细胞凋亡等,这些活性蛋白质可能对牛乳的生成及分泌产生一系列复杂的影响,从而导致牛乳酶凝乳特性的差异。

3 结 论

牛乳中乳蛋白组分种类及含量对牛乳酶凝乳特性具有不同程度的影响。添加WPC、κ-CN、β-LgA和β-LgB可在一定程度上促进酶凝乳,且在一定范围内,添加量与凝乳质量成正比;而α-La、α-CN、β-CN和CN的添加则对酶凝乳有一定的抑制作用。酶凝乳微观结构观察结果表明,添加WPC、κ-CN、β-LgA和β-LgB可以使酶凝乳微观结构更加紧密。采用动态光散射法测定酶凝乳过程中酪蛋白分子粒径的分布情况,发现酪蛋白溶液中添加WPC、κ-CN、β-LgA和β-LgB后,再加入凝乳酶,酪蛋白分子半径分布迅速发生变化,蛋白质分子趋于聚集。采用2-DE和质谱鉴定分析确定出6 组差异蛋白,其中3 组属于αS2-CN、2 组属于β-CN、1 组属于κ-CN,各差异蛋白组分与奶牛体内相关基因的表达、能量转化、酶的合成及蛋白质转运等的生物活性有关,不同的生理活性对牛乳的生成及分泌产生一系列复杂的影响,从而导致牛乳酶凝乳特性的差异。

猜你喜欢
酪蛋白牛乳组分
A1与A2 β-酪蛋白酸奶产品特性的比较
近红外定标法分析黏/锦/氨三组分纤维含量
蛋氨酸对奶牛乳腺酪蛋白合成及其上皮细胞自噬的影响
组分分发管理系统在天然气计量的应用
牛乳中脂肪掺假检测技术的研究进展
β-酪蛋白的功能特性及其在婴儿配方乳粉中的应用研究进展
煤的族组分基本特性研究
牛乳的滋气味与调香初探
用毛细管电泳检测牦牛、犏牛和藏黄牛乳中β-乳球蛋白的三种遗传变异体
酪蛋白对双羧基1,8—萘酰亚胺荧光探针聚集诱导发光效应的光谱研究及分析应用